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Screening and Identification of Omega-5 Gliadin Mutants in Wheat Doubled-Haploid Lines
밀 반수체 계통에서 오메가-5 글리아딘 돌연변이의 선발 및 동정
Korean J Breed Sci 2018;50(3):181-192
Published online August 31, 2018
© 2018 Korean Society of Breeding Science.

You-Ran Jang1, Chon-Sik Kang2, Sun-Hyung Lim1, and Jong-Yeol Lee1,*
장유란1, 강천식2, 임선형1, 이종열1,*

1National Institute of Agricultural Science, RDA, Jeonju, 54874, Korea,
2National Institute of Crop Science, RDA, Jeonju, 55365, Korea
1농촌진흥청 국립농업과학원,
2농촌진흥청 국립식량과학원
Correspondence to: (E-mail: jy0820@korea.kr, Tel: +82-63-238-4616, Fax: 063-238-4604
Received April 13, 2018; Accepted May 19, 2018.
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Gliadin proteins are a major component of gluten proteins and important determinants of bread-making quality by conferring the viscosity and extensibility of dough, but also present significant health problems for consumers with wheat-related diseases like celiac disease or wheat allergies. In order to solve this problem, we conducted RP-HPLC analysis to profile gliadin fractions for screening the mutants deficient in gliadins from 122 wheat doubled-haploid (DH) lines cultivated by the National Institute of Crop Science. Comparing the RP-HPLC chromatogram of 122 DH lines with those of the respective parents, we found that some peaks of omega-5 gliadin were not present in 28 DH lines. Further analysis using SDS-PAGE and A-PAGE showed that the omega-5 gliadin in the parental varieties had two to three bands, but only one band in the absent 28 DH lines. The relative expression levels of all gliadin groups in the parental and mutant lines were also examined by RP-HPLC. Our study contributes to establishing a method for the rapid screening and identification of mutants missing gliadins as major epitopes of wheat-related disease in many wheat genetic resources and breeding lines as valuable information to other researchers.

Keywords : allergen-reduced wheat, gliadin proteins, mutant, omega-5 gliadin, wheat
서언

밀 저장 단백질은 염에 용해되는 비글루텐 단백질과 용해되지 않는 글루텐 단백질로 분류되며, 이는 각각 밀 단백질의 20~30%와 70~80%를 차지한다. 글루텐 단백질은 다량체로 존재하는 글루테닌과 단량체로 존재하는 글리아딘으로 분류된다(Wieser 2007). 글루테닌은 단백질 1차 구조와 분자량에 따라 약 66-88kDa의 고분자 글루테닌(High molecular weight; HMW-GS)과 약 30-40kDa의 저분자 글루테닌(Low molecular weight; LMW-GS)으로 나뉘며, 분자 내 및 분자 간 이황화 결합을 형성하고, 밀 반죽에 탄성을 부여한다(Cornish et al. 2006, Payne 1987, Singh & Shepherd 1988, Wasik & Bushuk 1975). 고분자 글루테닌은 1번 염색체 장완에 존재하며 Glu-A1, Glu-B1 그리고 Glu-D1에 의해 암호화 된다(Shewry et al. 1995). 6배체 보통 밀은 3-5개의 고분자 글루테닌을 포함하는데, 이는 각각 83-88kDa에 존재하는 x-type과 66-75kDa에 존재하는 y-type으로 분류된다(Forde et al. 1985, Payne et al. 1981, Payne 1987, Payne & Lawrence 1983, Shewry et al. 1995, Wieser 2007). 저분자 글루테닌은 1번 염색체 단완에 존재하며 Glu-A3, Glu-B3 그리고 Glu-D3에 의해 암호화 되고, SDS-PAGE의 이동성(mobility)에 따라 B, C 그리고 D 서브유닛으로 분류된다(D’Ovidio & Masci 2004). 저분자 글루테닌 유전자를 발현시키는 Glu-3는 글리아딘 유전자 일부를 발현시키는 Gli-1 위치와 염색체 상에서 밀접하게 연관되어있다(Gao et al. 2007, Pogna et al. 1990, Ruiz & Carrillo 1993, Wieser & Kieffer 2001).

글리아딘은 저장단백질의 40-50%를 차지하는 글루텐의 주요 구성 성분으로(Anderson et al. 1997) 30-75kDa에 존재하고(Fido et al. 1997), 단백질 1차 구조와 낮은 pH의 A-PAGE 또는 SDS-PAGE의 mobility에 따라 αβ-, γ-, ω5-, ω1, 2- 글리아딘 4그룹으로 나뉜다(Banc et al. 2009, Wieser 2007). 글리아딘은 이황화 결합을 형성하지 않거나, 사슬 내 이황화 결합을 형성하며, 밀 반죽에 점성 및 신장성을 부여하지만(Khatkar et al. 2002, Wieser 2007), 밀 알러지를 비롯한 심각한 밀 관련 질환을 유발한다.

αβ-글리아딘과 γ-글리아딘은 전체 글리아딘 단백질의 28-33%와 23-31%를 차지하는 주요 글리아딘 단백질이고, ω1, 2-글리아딘은 훨씬 적은 4-7%를 차지한다. αβ-글리아딘은 6번 염색체 단완에 존재해 Gli-A2, Gli-B2 그리고 Gli-D2에 의해 암호화 되고, γ-, ω1, 2-글리아딘은 1번 염색체 단완에 존재해 Gli-A1, Gli-B1, Gli-D1에 의해 암호화 된다(Brown & Flavell 1981, DuPont et al. 2004, Ferranti et al. 2007, Wieser & Kieffer 2001, Wrigley & Shepherd 1973). α-, γ-, ω1, 2-글리아딘은 밀 질환인 셀리악병(Celiac Disease; CD)에 불내성(intolerance)을 일으키는 주요 항원이다. 셀리악병은 소화된 밀 글루텐에 대한 과민반응으로 만성염증성질환(chronic inflammatory disease)이며 미국인구의 약 1%에 영향을 미친다(Maki et al. 2003). 셀리악병을 앓고 있는 환자들은 대부분 유전적으로 HLA-DQ2 유전자(소수의 경우 HLA-DQ8)를 가지고 있다(Keuning et al. 1976, Trabace et al. 1984). HLA-DQ는 항원제시세포(antigen presenting cell)에서 TG2 (tissue transglutaminase)에 의해 탈아미드화된 글루텐 펩타이드를 제시하여(Molberg et al. 1998) T-cell에서 비자기(non-self)로 인식하게 해서 부적절한 면역반응을 일으켜 융모 크기 위축 및 점막 평평화에 의해 설사나 흡수장애 증상을 보이게 하며 심하면 사망에까지 이른다(Fasano & Catassi 2001, Johansen et al. 1996, Lundin et al. 1993, Petronzelli et al. 1997). 상당히 빠른 속도로 증가 중이며 유일한 치료방법은 글루텐을 섭취하지 않는 것이다. 셀리악병의 항원인 α-글리아딘의 T세포 자극 항원 결정기는 PFPQPQLPY, PQPQLPYPQ 외 3개(Sollid et al. 2012, Tye-Din et al. 2010), γ-글리아딘은 PQQSFPEQQ, IQPEQPAQL 외 9개(Sollid et al. 2012), 그리고 ω1, 2-글리아딘은 PFPQPQQPF, PQPQQPFPW를 갖는다(Tye-Din et al. 2010).

ω5-글리아딘은 전체 글리아딘 단백질의 3-6%를 차지하며 1번 염색체 단완에 존재해 Gli-A1, Gli-B1, Gli-D1에 의해 암호화 된다(Wieser & Kieffer 2001). ω5-gliadin의 구조는 SRL로 시작되는 N-말단, FPQQQ와 QQIPQQ의 반복서열 및 C-말단으로 구성되어 있다(Battais et al. 2005, Dupont et al. 2004, Matsuo et al. 2005). ω5-글리아딘은 시스테인을 가지지 않아 이황화결합를 형성하지 않는다(Hisa & Anderson 2001, Kasarda et al. 1983). 또한 낮은 수준의 라이신을 함유하며(Kasarda et al. 1976) 반복서열에 많은 글루타민을 가지고 있다(Hisa & Anderson 2001). ω5-글리아딘은 밀 의존 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA)의 중심 항원이다. WDEIA는 밀 섭취 후 신체 운동을 할 경우 유발되는 음식 알러지로 민감한 사람에게 발생하며 두드러기와 저혈압과 같은 알러지를 유발하고, 심할 경우 사망에 이르게 한다. 주요 IgE 결합 항원 결정기는 QQIPQQQ와 QQFPQQ이다(Battais et al. 2005, Matsuo et al. 2004, Matsuo et al. 2005, Morita et al. 2003, Palosuo et al. 1999, Palosuo et al. 2001).

본 연구는 알러지 저감 밀 계통을 선발, 동정하기 위해 식량원 육성 밀 반수체 계통 122계통에서 RP-HPLC를 사용 선발하였고, 보다 자세한 분석을 위해 SDS-PAGE, A-PAGE를 이용하여 동정하였다. 이러한 분석법의 정립은 신규 알러지 저감 밀 육성 및 밀 핵심 집단 구축 시 유용하게 사용 될 수 있을 것이다.

재료 및 방법

재료

본 연구에 사용된 재료 DH1-122는 금강과 올그루를 모본, 부분으로 하는 반수체 배가 계통으로 농촌진흥청 국립식량과학원에서 2010년 육성하였으며, 2016년산 밀가루를 분양 받아 사용하였다. 표준품종 Chinese Spring과 CS nullisomic-tetrasomic line (N1AT1B, N1BT1A, N1DT1A, N6AT6B, N6BT6D, N6DT6B)은 일본 밀 유전자원 분양 기관인 National Bioresource Project와 미국 농업연구청(National Plant Germplasm System)에서 분양받아 2016년 증식하여 사용하였다.

글리아딘 추출

SDS-PAGE 분석을 위한 글리아딘 추출은 Dziuba et al. (2014)의 방법을 사용하였다. 비글루텐 단백질을 제거하기 위해 미세하게 분쇄한 밀 100 mg과 0.15 M NaCl 수용액 1 ml을 혼합하여 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 15000 × g에서 5분 동안 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 글리아딘을 추출하기 위해 침전물과 70% Ethanol 수용액 1 ml을 혼합하여 상온에서 12시간 동안 반응시키고 15000 × g에서 5분 동안 원심 분리하여 상등액 500 ul를 취해 동결건조하여 -20°C에 보관하였다.

RP-HPLC 분석을 위한 글리아딘은 밀 100 mg과 70% Ethanol 수용액 1 ml을 혼합하여 하루동안 상온에서 반응시킨 후, 상등액을 centrifugal vacuum evaporator (HT-4X, GeneVac Inc, Ipswich, UK)를 사용하여 건조하고 -20°C에 보관하였다.

A-PAGE 분석을 위한 글리아딘은 밀 100 mg에 60% Ethanol 1 ml을 혼합하여 상온에서 3시간 반응시키고, 14000 × rpm에서 10분 동안 원심 분리 후 상등액을 -20°C에 보관하였다.

RP-HPLC 글리아딘 분획의 프로파일링 및 상대적 발현량 조사

글리아딘 RP-HPLC 분석은 Agilent ZORBAX 300SB-C18 column (5 µm, 4.6 × 250 mm i.d., Agilent Technologies, USA)이 장착된 Waters Alliance e2695(USA)로 분석하였다. 용매 A와 B는 각각 0.1% 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA)이 포함된 물과, 아세토니트릴(Acetonitrile; ACN)을 사용하였다. -20°C에 보관중인 글리아딘에 sample buffer (0.1%TFA in 20%ACN) 300 ul를 섞어 제조하고 PVDF syringe filter (0.45 µm, Whatman, Maidstone, UK)로 걸러냈다. 단백질은 70분에 걸쳐 용매 B의 25%에서 50%의 선형구배로 용출되었다. 글리아딘의 RP-HPLC 분석은 65°C 컬럼 온도에서 1 ml/min의 유속으로 수행되었고, 210 nm의 파장에서 모니터링되었다.

크로마토그램의 각 글리아딘 서브유닛별 peaks의 면적(%)은 높이-면적 비법(Height-area method)으로 Waters Empower Pro (USA) 소프트웨어를 이용하여 확인하였고, 이를 두 번 반복해 평균값을 통해 상대적인 발현량을 확인하였다.

SDS-PAGE 분석

-20°C에 보관중인 글리아딘에 sample buffer (50 mM Tris-HCl pH6.8, 8% β-mercaptoethanol, 2% SDS, 20% glycerol) 300 ul를 혼합하여 2 ul씩 12.5% mini gel에 70 V로 한 시간, 130 V로 3시간 전기영동을 실시하였다. 로딩이 끝난 젤은 CBB-R250으로 한 시간 염색 후, 3시간 탈색하여 스캐너로 분석하였다.

A-PAGE 분석

12% A-PAGE gel에서 20 mA으로 3시간 pre-running을 실시하였다. 추출한 sample 200 ul을 취하여 loading dye(0.17% Methyl violet in 87% Glycerol) 300 ul와 섞어 제조하였다. 제조된 sample 2 ul를 12% A-PAGE gel에 로딩하여 2시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 0.2% CBB R-250, 5% ethanol과 12% trichloroacetic acid으로 overnight 염색하고 tap water에 6시간 동안 탈색하여 형성된 단백질 밴드 패턴을 분석하였다.

결과 및 고찰

RP-HPLC를 이용한 글리아딘 돌연변이 계통의 선발

본 연구는 글리아딘 단백질 일부가 결손 된 알러지 저감 밀 계통을 선발하기 위해 국립식량과학원에서 육성한 반수체 배가 계통 122종의 종자에서 글리아딘 분획을 추출 RP-HPLC 프로파일링 실험을 실시하였다. 본 분석법의 재현성과 정확성을 확인하기 위해 밀 유전⋅육종 연구의 재료로 활용되는 Chinese Spring (CS)과 각 글리아딘 그룹을 암호화 하는 1번 및 6번의 염색체 일부 또는 전체가 결손 된 CS 이수체 계통(CS aneuploid lines, Tables 1, 2)을 사용하여 ω1, 2-, ω5-, αβ-, γ 글리아딘의 위치 및 결손 된 부분을 확인하였다(Fig. 1). 각 크로마토그램에서 5-12분 사이의 peak는 ω5-글리아딘, 18-25분의 peak는 ω1, 2-글리아딘, 25-38분 사이의 αβ-글리아딘 그리고 38-56분 사이의 peak는 γ-글리아딘임을 확인하였다(Fig. 1, Table 1). 글리아딘 돌연변이 스크리닝을 위해 부모 계통인 금강, 올그루와 반수체 계통 122종의 글리아딘 RP-HPLC 분석을 실시한 결과, ω5-글리아딘이 결손 및 저감된 밀 28계통을 확인했고, 이 계통들의 글리아딘은 전반적으로 부모 계통보다 낮은 발현성을 보였음에도 γ-글리아딘 일부는 올그루보다 높은 발현성을 나타냈다(Fig. 2). Fig. 3에 나타난 바와 같이 금강과 올그루, DH5의 크로마토그램을 overlapping 하여 각 글리아딘 서브유닛의 발현량을 비교하였다. 금강의 ω5-글리아딘은 네 개의 피크로 각각 7.786분, 8.217분, 9.845분 그리고 10.215분에 나타났고, 올그루는 두 개의 피크로 7.786분과 10.215분에 나타났으며, 금강의 네 피크 중 두 개의 같은 피크를 갖는다. ω5-글리아딘이 저감된 밀 28계통은 금강과 올그루에서 동시에 존재하는 7.786분과 10.215분 피크가 나타나지 않거나, 발현량이 매우 적었다(Fig. 2). DH5의 γ-글리아딘은 대부분 금강과 올그루보다 발현량이 적게 나타났지만, 47.989분과 48.423분에 나타나는 두 peak만 올그루보다 더 높게 나타났다. 상대적인 발현량을 확인하기 위해 금강, 올그루, DH5에 대한 각 글리아딘 서브유닛별 peaks의 면적(%)을 두 번 반복해 평균값을 나타냈다(Table 2). ω5-글리아딘은 금강과 올그루에서 각 7.27%와 3.05%를 나타냈지만, DH5에서는 0.95%로 발현이 굉장히 저하 됨을 확인하였다. 반면, γ-글리아딘은 금강과 올그루에서 각 30.20%와 26.90%를 나타냈지만, DH5에서는 32.94%로 글리아딘 서브유닛 중 유일하게 부모계통보다 발현량이 많았다.

Chromosomal location and encoding gliadin genes of wheat cultivar ‘Chinese Spring’ and it’s aneuploid lines missing group 1 and 6 chromosome.

ChromosomeEncoding gliadin genesUsed aneuploid lines
1ASω1, 2-, γ-N1AT1B
1BSω5-, γ-N1BT1A
1DSω1, 2-, γ-N1DT1A
6ASαβ-N6AT6B
6BSαβ-N6BT6D
6DSαβ-N6DT6B

Relative expression levels of all gliadin groups in parental (Keumkang and Olgeru) and mutant line (DH5).

GliadinTime (min)KeumkangOlgeruDH5

Area (%)Area (%)Area (%)
ω5-5-127.273.050.95
albumin12-184.046.233.22
ω1, 2-18-256.266.346.25
αβ-25-3852.2357.4856.64
γ-38-5630.2026.9032.94

100100100

Fig. 1.

RP-HPLC analysis of gliadin proteins from the ‘Chinese Spring’ group 1and 6 aneuploid lines. Chromatograms of each aneuploid line are summarized in CS. Peaks corresponding to chromosomes 1A, 1B, 1D, 6A, 6B, and 6D are displayed in red, blue, green, light blue, yellow, and purple arrows, respectively.


Fig. 2.

Profile analysis of gliadin fractions using RP-HPLC in parental (Keumkang and Olgeru) and 122 DH lines. The red dotted box indicates the disappeared peaks.


Fig. 3.

Overlapping of RP-HPLC chromatograms of gliadins fractions of parental (Keumkang and Olgeru) and DH5 lines.


ω5- 글리아딘 저감 계통들의 SDS-PAGE 분석

RP-HPLC를 통해 선발된 28계통의 ω5-글리아딘의 부분 저감을 확인하기 위해 글리아딘을 추출하여 SDS-PAGE를 실시하였다. CS와 CS nullisomic-tetrasomic line (CSNT)을 사용하여 SDS-PAGE상의 45-66.2kDa에 ω5-글리아딘이 나타남을 확인하였다. 모본과 부본인 금강과 올그루는 ω5-글리아딘 부분에 각각 세 개, 두 개의 메이저 밴드로 나타났다. 선발된 28 반수체 배가 계통에서는 모본인 금강에 존재하는 세 개의 메이저 밴드가 전부 발현되지 않았고, 부본인 올그루에 존재하는 두 개의 메이저 밴드 중 먼저 분리된 밴드는 완전히 사라지고 나중에 분리된 밴드만 나타났다(Fig. 4).

Fig. 4.

SDS-PAGE analysis of gliadin fractions of CS, CSNT (N1AT1B, N1BT1A, and N1DT1A), Keumkang(K), Olgeru(O) and 28 cultivars of DH line. The red box indicates the disappeared bands


ω5- 글리아딘 저감 계통들의 A-PAGE 분석

RP-HPLC실험을 통해 ω5-글리아딘의 발현저하가 확인된 DH line의 28계통과 모본, 부본인 금강, 올그루를 비롯하여 CS 및 CS 이수체 계통(N1AT1B, N1BT1A, 및 N1DT1A)를 이용하여 A-PAGE를 수행하였다. CS와 ω5-글리아딘 부분이 null된 N1BT1A를 비교하여 ω5-글리아딘은 ω1, 2-글리아딘 2개의 밴드 밑에 2개의 밴드로 존재하며 N1BT1A에서 2개의 밴드 중 1개의 밴드가 결손이 되었다는 것을 확인하였다(Fig. 5). 28계통의 밀가루에서 추출된 글리아딘의 A-PAGE 결과는 모본, 부본인 대조군과 비교하였을 때 ω5-글리아딘 부분적 결손 및 γ-글리아딘 부분에 모본, 부본에는 없는 밴드가 확인되었다(Fig. 5).

Fig. 5.

A-PAGE analysis of gliadin fractions of CS, CSNT(N1AT1B, N1BT1A, and N1DT1A), Keumkang(K), Olgeru(O) and 28 cultivars of DH line. The yellow, blue, and green dotted box indicate the disappeared bands at N1AT1B, N1BT1A, and N1DT1A compared with the CS. The disappearing bands in the 28 cultivars is shown in red dotted box. On the contrary, the red box indicates the appeared bands.


ω5- 글리아딘 일부 단백질의 감소와 γ- 글리아딘 단백질의 증가

반수체 계통 28종의 RP-HPLC, SDS-PAGE 및 A-PAGE 분석에서 ω5-글리아딘 일부 단백질이 감소하고 새로운 γ-글리아딘 단백질의 증가하는 현상을 보였다. 이러한 현상은 벼와 밀의 저장 단백질 발현 조절 연구에서 흔히 볼 수 있으며, 한 그룹의 저장 단백질 유전자의 저감 또는 결손이 종종 다른 저장 단백질의 과 발현을 수반 한다는 것을 확인 시켜 준다(Becker et al. 2006). Waga & Skoczowski (2014)의 연구 결과에서도 비슷한 결과가 확인 되었는데, ω5-글리아딘 일부 단백질이 감소된 계통에서 새로운 저분자 글루테닌 발현을 확인하였다. 비슷한 연구 결과로 RNAi를 이용한 밀 ω5-글리아딘 유전자의 knock down 실험에서 모든 계통에서 거의 모든 ω5-글리아딘 단백질이 현저히 감소하였지만 한 계통에서는 3개의 고분자 글루테닌 및 s타입 저분자 글루텐 단백질이 발현이 저하되었고, s타입 저분자 글루텐, αβ-글리아딘의 일부, 비 글루텐 단백질인 separin 및 triticin의 발현량이 증가 된 것을 확인하였다(Altenbach et al. 2014). 본 연구팀의 벼 저장단백질의 조절 연구에서도 유사한 연구결과를 확인하였다. 벼 RNAi 기술을 이용한 글루테린, 프롤라민 및 글루불린 유전자의 단일 및 다중 저해 실험에서도 목적 저장 단백질의 knock down 효과로 인한 다른 저장 단백질이 보충(compensation)되는 결과를 확인 할 수 있었다(Cho et al. 2016, Kim et al. 2013, Lee et al. 2015).

RP-HPLC에 의한 알러지 저감 밀 스크리닝의 장점

밀은 AA, BB, DD 염색체의 6배체(2n=6x=42, AABBDD) 및 16Gb의 heterogeneity를 보이고, 아직 유전체 연구도 draft 수준이여서 유전체를 활용한 밀 유전, 육종 연구에 많은 어려움이 있다(Nasuda et al. 2016). 특히 글리아딘 단백질은 1A, 1B, 1D, 6A, 6B, 6D의 locus에 존재하며 품종에 따라 약 100~200의 copy가 있는 것으로 알려져 있고 각 글리아딘 그룹 내의 염기서열 및 아미노산 서열의 차이가 적어 적절한 DNA 마커 개발에 어려움이 많다(Barak et al. 2015). 미국 밀 Butte 86의 이차원전기영동 및 MS/MS에 의한 총 저장 단백질의 단백체 지도 작성 결과를 보면 약 230개의 단백질이 존재하는 것으로 보고 하였다(Dupont et al. 2011). 현재 ω1, 2-, ω5-, αβ-, γ- 글리아딘 특이(Anderson et al. 2009, Anderson et al. 2001, Kawaura et al. 2005, Matsuo et al. 2005, Noma et al. 2016, Qi et al. 2009, Wang et al. 2017) 및 locus 특이(Wang et al. 2017, Zhang et al. 2003) DNA 마커가 개발 되어 있으나 모든 글리아딘 그룹의 유전자를 대표하지 못하고 개수 또한 많아 많은 수의 밀 계통의 스크리닝(geno-typing)시 효과적이지 못하다. 반면 RP-HPLC에 의한 분석은 모든 ω1, 2-, ω5-, αβ-, γ- 글리아딘 그룹들을 확인가능하며 높은 재현성과 자동화로 비교적 빠른 시간에 효과적으로 phenotyping 할 수 있는 기술이다. RP-HPLC에 의해 확인된 글리아딘 돌연변이 계통은 SDS-PAGE, A-PAGE, 이차원전기영동 및 MS/MS에 의해 추가 분석이 요구 된다.

적요

밀 글리아딘 단백질은 밀 글루텐 단백질의 중요 구성 성분으로 밀 반죽 물성의 점성, 신장성에 영향을 미치며 밀 알러지와 셀리악병 등 밀 관련 질환의 중요한 알러젠으로 작용한다. 이를 해결하고자 주요한 글리아딘 단백질이 결손 된 밀 돌연변이 계통을 찾기 위해 국립식량과학원에서 육성한 밀 반수체 배가 계통 122종에서 글리아딘 분획을 추출 RP-HPLC를 이용하고 글리아딘 프로파일링 실험을 실시하였다. 반수체 122계통의 크로마토그램을 부모 계통과 비교해 본 결과, 28계통에서 오메가-5 글리아딘의 일부 peak가 사라진 것을 확인했다. SDS-PAGE와 A-PAGE 추가 분석에서 부모 계통에서는 오메가-5 글리아딘이 2~3밴드였으나 28계통에서는 하나의 밴드를 보였다. 또한 RP-HPLC를 이용 부모 계통과 돌연변이 계통에서 모든 글리아딘 그룹의 상대적 발현 양을 조사하였다. 본 연구는 많은 밀 유전자원, 육종 계통에서 글리아딘 결손 및 저감 밀을 신속하게 스크리닝하고 동정하기 위한 분석법 확립을 위한 중요한 기초자료로 활용 될 것이다.

사사

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구개발사업(과제번호: PJ012458) 및 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(과제번호: PJ013149 및 PJ013159) 지원에 의해 이루어진 것임.

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December 2018, 50 (4)
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