갓(Leaf mustard: Brassica juncea)은 배추과에 속하는 채소류 중 하나로 우의 삼각형(U’s triangle)에 따르면 배추(AA, 2n=20)와 흑 갓(BB, 2n=16)의 복이배체(amphidiploid, AABB, 2n=36)종으로 알려져 있으며(Yang et al. 2016), 국내에서는 여수 지역에서 많이 재배되어 오고 있다. 갓의 독특한 맛은 글루코시놀레이트(glucosinolate, GSL)의 일종인 sinigrin이 가수분해되어 나오는 allyl iso-thiocyanate (AITC)에 기인한다. 이로 인해 갓은 독특하면서도 톡 쏘는 맛을 가지게 된다(Dai et al. 2014). 갓 가공식품인 갓김치는 칼륨 등 무기질 영양이 풍부하여 지역특산물로서 발전하고 있기 때문에 농업적으로 우수한 형질을 가지는 다양한 용도의 갓을 개발하는 것은 중요하다.

전통적인 교배 육종 방식을 이용해서 유전적으로 고정된 식물을 얻기 위해서는 대략 8세대의 자가 교배가 필요하다(Rahman et al. 2016). 약배양(anther cultivation)과 소포자 배양(microspore cultivation)은 이러한 시간을 줄여서 한 세대 만에 100%의 동형 접합(homozygosity) 식물을 얻을 수 있다(Forster et al. 2007, Joosen et al. 2007, Kwak et al. 2012, Rahman et al. 2016, Wędzony et al. 2009). 이처럼 빠르게 동형 접합 식물을 생산하는 두 기술 중, 소포자 배양의 경우 약배양에서 약벽에 의해 유래하는 식물체나 기관 분화를 미리 방지할 수 있어서 더 유용하다 할 수 있다(Ferrie et al. 2011).

배추과 작물의 경우 대표적 타식성 채소이기 때문에 다른 작물에 비해 소포자 배양 연구가 빠르게 시작되었다. 배추과 작물 중 유채에서 최초로 소포자 배양에 성공하였고(Lichter 1982), 이후 배추과 작물을 포함하여 다양한 작물에서 소포자 배양이 수행되었다. 1989년 배추(Brassica campestris spp. pekinensis)에서 소포자 배양을 성공하였고(Sato et al. 1989), 1992년 Brassica rapa L. ssp. Oleifera (Burnett et al. 1992), 1994년 박초이(Brassica rapa L. ssp. chinensis)의 소포자 배양을 이어서 성공 시켰다(Cao et al. 1994).

소포자 배양은 식물의 개화하지 않은 미성숙 꼬투리에서 소포자(microspore)를 분리하고 배 발생(embryo genesis)을 걸쳐 반수체(haploid) 또는 동질 배수체(doubled haploid, DH)를 생성하는 배양 기술이다(Ferrie et al. 2011). 배양 과정 중에서 동질이배체화 되는데, 이배체화가 되지 않으면 콜히친(colchicine) 처리를 한다. 콜히친 처리 시기 및 조건들은 작물에 따라 다양하다. 본 연구에서 수행한 B. juncea의 소포자 배양은 선행연구(Kim et al. 2019)를 통해 확립한 조건을 이용하여 콜히친 처리 후 배가 반수체를 형성하였다.

소포자 배양 과정 중 재분화 식물 발생 효율을 높이기 위하여 소포자는 핵분열하기 직전 상태인 미성숙 소포자를 수집하는 것이 중요하다. 성숙단계에 접어든 소포자를 이용하여 소포자 배양을 진행하면 독성물질이나 억제 물질이 발생하여 효율을 떨어트린다는 연구 결과가 있다(Kott et al. 1988a, Kott et al. 1988b). 실제로 소포자 배양의 배 발생 효율과 식물체까지 발생하는 비율은 매우 낮다. 그리고 그 비율은 작물별로 다양하다(Gu et al. 2014, Takahira et al. 2011, Yuan et al. 2012). B. rapa의 경우 소포자 배양 전 사전 고온 처리 시(33°C) 더 많은 배아(embryo)가 발생하는 것을 확인하였다(Zhang et al. 2012). 박초이는 2일간 32°C 처리 시 배 발생 효율이 높아지는 것을 확인하였다(Seo et al. 2014). B. juncea의 경우 배지의 sucrose 비율을 달리하여 배 발생 효율을 높이려는 연구가 수행되었고(Lionneton et al. 2001), PCIB (p-chlorophenoxyisobutyric acid)처리 시 배 발생률이 5배 증가한다는 연구 결과도 보고되었다(Agarwal et al. 2006). 최근에는 콜히친 처리 농도와 시간을 달리하여 복이배체의 식물체의 재분화 비율을 향상시킨 연구도 수행되었다(Kim et al. 2019).

GSL은 배추과 작물에서 많이 합성되는 이차대사산물이며 항산화 물질로 잘 알려져 있다. 또한 섭취할 경우 항암효과가 있다고 보고되어 있다(Frazie et al. 2017, Soundararajan et al. 2018). GSL은 곁사슬(side chain)의 구조적 차이로 인해 지방족(aliphatic), 방향족(aromatic), 인돌(indole)로 구분된다. 지금까지 약 200종류의 GSL이 보고되었으며(Clarke 2010), 갓의 경우 10종류의 GSL을 확인할 수 있었다. 본 연구는 안토시아닌, GSL 함량 등 기능성 성분이 우수하고, 잎 수가 많은 양친을 소포자 배양하여 다양한 DH 갓 집단을 개발하였다. 이들의 주요 농업적 형질을 조사하고 GSL 함량을 분석하여 GSL 함량이 높고 품질이 우수한 기능성 갓 자원을 선발하였다. 새롭게 육성한 갓 소포자 배양 집단의 모본은 안토시아닌 함량이 높았고, 분리집단에서 안토시아닌은 우성유전 함을 표현형을 통해 확인할 수 있었다. 갓 소포자 배양으로 잎색과 잎모양이 다양하게 생산된 고정계통들은 갓 채 등으로 새로운 품종으로 활용될 수 있을 것이다.

식물 재료

국립농업과학원에서 진행한 선행연구(돌산갓 유전 집단 육성과 김치 맛 특화 유전 마커 탐색, 과제 번호: PJ013156)결과 소포자 배양 기술로 개발한 DH 갓 집단 중 우수한 표현형을 보이는 두 고정계통을 양친으로 사용하였다. 선행연구에서 자람이(Jarami)를 소포자 배양하여 얻은 BjDH07-7 (GSL 26.23μmol/g dry weight, 자색 잎)을 모본으로 이용하였고, 일반 갓 보다 같은 성장 시기에 잎 수가 많은 BjDH01_36 (GSL 10.57μmol/g dry weight, 녹색 잎)을 부본으로 이용하여 F₁을 만들었다. 이후 F₁ 14개체를 온실에서 육성하여 소포자 배양 소재로 사용하였다.

소포자 분리 배양 및 콜히친 처리를 통한 DH 식물 육성

소포자 배양 전 과정은 Kim et al. (2019)과 Seo et al. (2014)의 방법에 따라 수행되었다. 2.5 mm에서 3.5 mm 크기의 화뢰(bud)를 배지에 섞어 분쇄하여 소포자를 추출하였다. 이후 32℃ 진동기(shaker)에 2일간 암 배양시켰다. 이들을 25℃ 배양기에 옮기고 15일간 추가적 암 배양을 통해 배 발생을 유도하였다. 발생한 배아들을 MS 배지에 치상하여 잎과 뿌리들을 순차적으로 유도하였다. 약 50~60일간 계대 배양하여 뿌리가 잘 활착한 경우, 식물체를 기내에서 분리하여 증류수로 잘 세척한 후, 뿌리가 잠길 정도의 0.34% 콜히친 용액 내에서 3시간 처리하였다. 이후, 온실 상토(bed soil)에서 순화시키고 3주간 키운 식물들은 유세포 분석기(CyFlow Ploidy Analyser, Sysmex, Germany)를 이용하여 배수성 검정하였다. 이배체로 확인된 식물들은 4℃에서 35일간 16시간/일 광주기로 춘화처리(vernalization)하고, 이후 온실에서 16시간/일 광주기로 육성하였다. 대부분의 소포자 배양 갓들의 유전형은 복이배체(4n_AABB)이어서 개화한 꽃들은 자가수분이 잘 되었고, 일부 종자가 잘 안 맺히는 식물들은 뇌수분(bud pollination)을 진행하여 채종 및 정선하였다.

117개 DH line의 표현형 특성 조사

117개 고정계통들의 명칭은 모계인 BjDH07-7번 유래 분리집단으로 표기하고자 BjDH07_001에서 BjDH07_117번으로 명명하였다. DH 분리집단에서 채종한 종자들을 5일간 25℃ 조건 배양실에서 발아시킨 후 50공 육묘 상자에 이식하였다. 본엽이 4-5매 전개된 4주차 식물들을 포장에 정식하고 6주간 재배한 후 형질을 조사하였다(Supplementary Fig. 1). 조사 방식은 농림축산식품부 국립종자원에서 발간한 “품종보호 출원과 심사를 위한 작물별 특성 조사기준, 갓(Leafy Mustard, Brassica juncea L. Czern.)”에 따라 수행하였다(Korea Seed and Variety Service 2021). DH line 각각의 잎 수, 잎 길이/너비, 잎 색(자색/녹색), 잎자루의 길이, 잎자루의 너비, 무게 등의 항목을 조사하였다.

HPLC를 활용한 DH line을 대상으로 GSL 함량 분석

소포자 배양을 통해 개발한 117개 고정계통 DH 집단의 GSL 함량을 Cuong의 방식을 참고하여 수행하였다(Cuong et al. 2018). 각 개체를 온실에서 5주간 육성한 뒤 동결 건조해 분말 시료를 준비하였다. 이후 준비된 분말 시료 50mg에 70% (v/v) MeOH을 넣어 진동 교반(vortexing) 한 후, 70℃ 항온수조에서 5분간 추출하고 원심분리하였다. 상층액을 모으고 같은 과정을 2회 반복하여 최종 1.5~1.7 mL의 추출물을 얻었다. 이후 추출물을 0.5 M sodium acetate (pH 4.0)을 넣어 H⁺ 형태로 활성화된 diethylaminoethyl (DEAE)-Sephadex A-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) column에 흡착시키고 3차 증류수로 씻어주었다. 이후 column의 아랫부분을 막고 aryl sulfatase solution (23mg/mL) 60μL를 넣어 16시간 상온에서 방치하였다. Desulfation된 GSL을 0.9 mL (0.3 mL×3)의 증류수로 용출 시키고 원심분리하였다. 준비된 샘플을 227 nm, 40℃, 0.7 mL/min (flow rate) 조건의 HPLC (HITACHI Chromaster, HITACHI, Japan)를 이용하여 분석하였다. 모든 시료는 5반복으로 분석하였다. 표준 물질인 sinigrin을 0.1mg/mL의 농도로 만든 후, 위의 방법대로 하여 desulfo-sinigrin을 준비하였고 HPLC로 분석하였다. 각각의 표준물질들을 위와 같이 desulfation 하였고 분석 결과는 건조 중량 당 μ mol/g로 표시하였다.

배 발생 비율에 따른 소포자 배양 효율과 복이배체 생산 비율

F₁에서 수집된 bud, 발생한 배아, bud 당 발생한 배아 그리고 재분화된 식물(regenerated plant) 수를 조사하였다. 전체 bud의 수는 2,010개 여기서 발생한 배아는 총 15,526개, 전체 bud당 발생한 배아 수는 7.62개, 재분화된 식물은 218개였다(Table 1). Chanana et al. (2005)에 따르면 6개의 서로 다른 B. juncea 품종을 소포자 배양하고, 여기서 발생하는 배아의 비율을 분석했을 때 가장 높은 것은 Rajat 품종이며 bud당 발생한 배아의 개수는 35.1개였고, 가장 낮은 값은 Pusa Bold 품종으로 3.66개로 확인되었다. 일반적으로 배 발생 효율에 영향을 미치는 가장 큰 요소는 식물의 유전자형이다. 특히 품종 간에도 크게 다르다고 알려져 있다. 유전자형이 달라지면 소포자 배양으로 인한 배 발생 비율이나 식물체 발생 능력이 달라진다(Zhang et al. 2008, Lantos et al. 2009).

Table 1

Number of buds, regenerated embryos and embryo per bud derived from micropsore in B. juncea.

F1z	Number of Cultured Buds	Number of Obtained Embryos	Embryo per Bud	Regenerated Plants
7×36 (1)	170	1959	11.52	47
7×36 (2)	130	1248	9.60	17
7×36 (3)	150	1351	9.00	20
7×36 (4)	180	747	4.15	5
7×36 (5)	160	1050	6.56	6
7×36 (6)	90	866	9.62	7
7×36 (7)	160	1964	12.27	40
7×36 (8)	130	1112	8.55	31
7×36 (9)	200	1886	9.43	9
7×36 (10)	110	556	5.05	12
7×36 (11)	150	1334	8.89	8
7×36 (12)	150	580	3.86	8
7×36 (13)	140	383	2.73	2
7×36 (14)	90	490	5.44	6
Total	2010	15526	7.62±2.97y	218

^z7x36 indicates the F₁ plants derived from across between BjDH07-7 and BjDH01_36.

^yMean of 14 independent experiments±SD.

소포자 배양 시 중요한 요소 중 하나는 스트레스 처리이다. 본 연구에서는 B. juncea 소포자 배양에 적합한 고온 처리 조건으로 알려진 32℃에서 2일간 처리하였다. 이를 통해 소포자는 배우체(gametophyte)에서 포자체(sporophyte)로 전환되고, 그 결과 소포자를 통한 배 발생이 가능하게 된다(Ferrie el al. 2011, Weijun et al. 2002).

Bud의 크기는 소포자 핵의 발달단계를 예측할 수 있는 중요한 수단이다. 4분자기(tetrad)에서 1핵기(uninucleate), 2핵기(binucleate)를 거쳐 성숙 꽃가루 형성 전까지의 단계를 bud의 크기로 구분할 수 있다(Babaei et al. 2021). 전형성능(totipotent)을 가지는 1핵기 말(late uninucleate) 단계는 소포자 배양에 의한 배 발생에 적합한 단계이며, B. juncea의 경우 3.1 mm에서 3.5 mm 크기의 bud가 1핵기 말인 것으로 알려져 있다(Prem et al. 2008). 하지만 bud의 크기와 소포자 핵의 발달단계의 상관관계는 품종에 따라 달라진다. 유채의 서로 다른 세 가지 품종을 비교했을 때 각각 소포자 발생에 가장 효과적인 bud 크기가 다르다는 것을 확인하였다(Kim et al. 2008). 본 연구에서는 이러한 결과를 바탕으로 하여 2.5 mm에서 3.5 mm 사이의 bud를 수집하여 소포자 배양을 하였다.

재분화된 shoot를 계대 배양하여 식물체로 유기한 후 뿌리를 유기하였다. 이후 건전한 뿌리가 형성된 식물들을 0.34% 농도의 콜히친 용액에 담가 배수화를 유도하였다. 일반적으로 이배체(diploid)인 B. rapa, B. oleracea의 경우 반수체에서 자연적으로 배수화가 되는 비율이 높지만(Gu et al. 2003), B. juncea의 경우 복이배체(allotetraploid)로 콜히친 처리 없이는 자연 배수화 비율이 매우 낮다. 본 연구에서는 반수체에 콜히친 처리를 하였고, 전체 218개의 재분화 식물 중 149개의 복이배체 식물을 확보하였고 68.3%로 배수화되는 것을 확인할 수 있었다. Wan et al. (2011)은 복이배체인 B. napus를 소포자 배양하여 얻은 반수체에 콜히친을 처리하였고, 그 결과 콜히친의 농도와 처리 시간에 따라 배수화 비율이 59.3%에서 최대 81.5%까지 다양하다 나타나는 것을 확인하였다. 본 연구에서 콜히친 처리에도 배수화되지 않고 haploid (AB) 상태로 남아있는 계통은 61개였고, 다배체를 형성한 계통도 8개로 확인되었다(Table 2). 이들 중 결실 이후 종자 정선까지 살아남은 117개의 DH 집단을 활용하여 이후 분석을 수행하였다.

Table 2

The ploidy ratio of B. juncea haploid plantlets after colchicine treatment and doubling efficiency.

Type	Haploid (AB)	Doubled Haploid (AABB)	Polyploid	Total Regenerated Plants	Doubling Efficiency (%)z
F1	61	149	8	218	68.3

^zDoubling efficiency (%)=(Number of DH/ Number of Total Regenerated Plants)×100, DH, doubled haploid.

117개 DH line과 양친 간의 표현형 비교

잎의 형태(leaf shape)의 경우 전연형(spatulate), 열편형(petiolate), 분리형(divided)으로 구분하였다. 모본인 BjDH07-7은 열편형 이고, 부본인 BjDH01_36은 전연형이었다. 117개의 고정계통 DH 집단 중 42개는 전연형을 보이고 나머지 75개는 열편형을 보였으며, 분리형은 나타나지 않았다. 한 개 개체는 생육이 불안정하여 확인할 수 없었다. 잎 색(leaf color)은 모본인 BjDH07-7은 안토시아닌에 의해 자색을 보였고, 부본인 BjDH01_36은 진한 녹색을 보였다. 분리집단에서 BjDH07_036은 모본 보다 더 진한 자색을 보였다. BjDH07_011의 경우 결각의 깊이가 매우 깊고 열편형을 보였으며, BjDH07_066의 경우 모본인 BjDH07-7과 같이 자색을 띠면서도 부본인 BjDH01_36과 같이 전연형을 보였다. BjDH07_ 035의 경우 BjDH07-7과 같이 열편형이지만 색은 BjDH01_36과 같이 진한 녹색을 보였다. BjDH07_071, BjDH07_074, BjDH07_116의 경우 각각 양친에서 가지지 않는 잎 면의 표면 요철이 있거나, 선형(linear)잎을 가지거나, 원형(orbicular)의 잎의 표현형을 보였다(Fig. 1).

Fig. 1. Phenotype of the DH population from microspore culture. a. Parents of F₁ b. DH lines from F₁ with unique phenotypes.

잎 색은 자색의 정도에 따라 ‘1~4’ 단계로 구분하였다. 자색을 띠지 않는 녹색 계통을 “1”, 잎맥을 따라 약한 자색의 경우 “2”, 잎맥뿐만 아니라 잎의 가장자리까지 자색일 때 “3”, 엽병을 제외하고는 전반적으로 자색을 보이는 경우 “4”로 구분하였다(Supplementary Fig. 2). 자색을 보이는 2~3단계 계통은 각각 11개, 50개, 4개였고 1단계의 녹색 계통 52개로 자색과 녹색의 분리비는 65:52임을 확인할 수 있었다. 자색의 잎과 녹색 잎을 가진 B. juncea에서 서로 간의 전사체를 비교 분석한 연구에서 자색의 잎은 BjTT8, BjMYC 유전자와 안토시아닌 생합성 유전자(BjC4H, BjDFR and BjANS)의 상향 조절(up-regulation)에 의해서 자색잎이 촉진됨을 확인하였다(Heng et al. 2020). 또한 전사체 분석을 통해 BjDFR, BjTT19, BjTT8이 녹색 잎에 비해 자색 잎에서 현저하게 상향 조절됨을 밝혔다(Zhang et al. 2020).

잎 자세(leaf shape)는 그 형태에 따라 직립, 반 직립, 수평 형태로 나누었고, 대부분 양친과 동일하게 반 직립 형태를 보였고 일부 개체에서 직립과 수평 형태를 보였다. 양친 잎 수(leaves number)의 경우 BjDH07-7은 15개 BjDH01_36은 22개였고, DH 집단의 경우 최소 12개부터 28개까지 다양하게 분포하였다. 잎 길이는 최대 46.0 cm에서 최소 23.9 cm를 보였고 표준편차는 4.77이었다. 잎 너비는 최대 20.0 cm에서 최소 8.40 cm였고 표준편차는 2.65였다(Fig. 2 and Table 3).

Table 3

The phenotype values of 117 DH lines.

Samples	Leaf length (cm)				Leaf width (cm)				Petiole length (cm)				Petiole width (cm)				Leaf number (count)				Plant weight(g)
	mean ±SDz	Min	Max		mean ±SD	Min	Max		mean ±SD	Min	Max		mean ±SD	Min	Max		mean ±SD	Min	Max		mean ±SD	Min	Max
117 DH lines	35.7 ±4.77	23.9	46.0		15.04 ±2.65	8.40	20.0		2.22 ±0.99	0.60	5.50		1.78 ±0.38	0.90	3.20		17.75 ±3.44	12.00	28.00		216.09 ±103.83	55.0	575
BjDH07-7	42.5				21.5				3.20				2.50				15.00				305
BjDH01_36	39.5				17.5				2.50				2.00				22.00				220

^zMean±standard deviation (SD), minimum (Min), and maximum (Max) values for the leaf length and width, petiole length and width, and leaf number and plant weigh.

Fig. 2. a. Measured leaf traits. b. Frequency distributions of 117 DH lines for yield related traits; leaf length, leaf width, petiole length, petiole width, leaf number, weight; each red and blue dashed line indicates values of BjDH07-7 and BjDH01_36.

이러한 DH 집단들은 일반적으로 유전 연관 지도(genetic linkage map)나 새로운 특성에 관련한 분자 마커 그리고 QTL (quantitative trait locus)분석과 MAS (marker-assisted selection)의 기반이 된다. 그렇기 때문에 본 연구와 같이 다양한 특성을 지니는 DH 집단을 빠른 시간 안에 생산하는 것은 중요하다. DH를 활용한 연구는 다양하며 실제로 B. napus의 경우 병 저항성, 종자의 특징, 식물의 구조 등 농업적으로 유용한 특성에 관련한 분자 메커니즘, 유전자/QTL에 관련한 새로운 연구들이 진행되었다(Kumar et al. 2018, Larkan et al. 2016).

GSL 함량 분석 결과: 각 DH line의 함량과 주요 GSL 구성

117개 DH line과 양친의 GSL 함량을 분석하고 히스토그램으로 표현하였다. 함량이 가장 높은 계통은 BjDH07_011로 29.27 μmol/g dry weight를 보인 것과는 다르게 BjDH07_104의 경우 6.39 μmol/g dry weight였고, 이는 전체 계통 중 가장 낮은 함량이었다. 평균값은 15.42, 중앙값은 14.68, 표준편차는 4.9로 나타났다. GSL 함량 값의 정규성을 확인하기 위하여 수행한 샤피로-월크 정규성 검정에서, 검정 통계량(W)은 0.96165이며 p-value는 0.0018로 측정되었다. 유의 수준 0.05에서 검정 결과 GSL 함량은 정규분포를 따르지 않았다. DH line 중 4개 유전형의 GSL 값은 모본 보다 높았고, 15개의 유전형은 부본보다 낮은 값을 보였다(Fig. 3). 이를 통해 모본과 부본의 특정 대립형질이 재조합되어 초월 분리(transgressive segregation)되었음을 예측할 수 있었다(Mackay et al. 2021, Rieseberg et al. 1999).

Fig. 3. Histogram for distribution pattern of glucosinolate contents about 117 DH lines; blue dashed line means paternal value of glucosinolate and red dashed line means maternal value of glucosinolate.

GSL은 그 형태에 따라 지방족(Aliphatic), 인돌(Indolic) 그리고 방향족(Aromatic)으로 구분할 수 있으며 이들의 생합성 경로에 관여하는 유전자는 각각 다르다. 그래서 주성분 GSL을 명확히 한다면 향후 원인 유전자를 스크리닝할 때 범위를 좁혀 줄 수 있을 것이다. 갓에서는 지방족 5종류(sinigrin, gluconapin, glucoiberverin, glucobrassicanapin, gluconapoleiferin) 인돌 4종류(4-hydroxyglucobrassicin, glucobrassicin, methoxyglucobrassicin, neoglucobrassicn) 방향족 1종류(gluconasturttin)로 총 10가지의 GSL이 확인되었다. 이 10가지 종류의 각각의 값을 합하여 전체 GSL 함량으로 표현하였다. 117개 DH line에서 대부분이 지방족이었고 그중에서도 sinigrin이 전체 함량의 약 89%로 가장 높은 비율을 차지하였다. 그 뒤를 이어 지방족 gluconapin이 약 4.7% 인돌인 glucobrassicin과 methoxyglucobrassicin이 약 2.3%, 1.5% 비율을 차지하였다(Fig. 4). BjDH07-7, BjDH07_011, BjDH07_104의 경우 sinigrin이 전체 GSL 함량의 94%, 87%, 93%를 차지하였고, BjDH07-7에서는 다른 지방족 GSL은 확인되지 않았으며 sinigrin에 이어 gluconasturittin이 3.2%, 4-hydroxyglucobrassicin이 전체 함량의 1%를 차지하였다. BjDH07_011의 경우 gluconapin, glucobrassicin, methoxyglucobrassicin이 각각 전체 함량의 7.6%, 2.0%, 1.7%를 차지하였다. BjDH07_104의 경우 methoxyglucobrassicin, gluconapin, glucobrassicin이 각각 2.0%, 1.8%, 1.6%를 차지하였다. 이를 통해 갓에서 gluconapin, glucobrassicin, methoxyglucobrassicin이 DH line 별로 미세한 비율 차이를 보일 수 있지만, 갓에서 주된 GSL은 sinigrin임을 확인할 수 있었다.

Fig. 4. Constitution of glucosinolate components in 117 DH lines.

GSL 함량과 4단계로 나눈 자색의 단계 간의 상관관계를 분석했지만, 유의미한 결과는 얻을 수 없었다. 또한 잎의 길이나 다른 조사한 표현형과 GSL 함량 사이의 결정적인 상관관계는 발견할 수 없었다(Supplementary Fig. 3). 이는 60종의 leafy mustard의 잎 색과 GSL 함량의 상관관계를 조사한 연구와 유사한 결과였다(Huang et al. 2022).

본 연구에서는 소포자 배양을 이용하여 117개의 B. juncea 고정계통 DH 집단을 개발하였고, 이차대사산물인 GSL 함량과 표현형 특징을 분석하였다. 이 집단의 우수한 형질이나 독특한 형질들을 각 개체의 유전체 정보와 연계하여 해당 형질들의 원인 유전자를 규명할 예정이다. 이를 활용하여 개발한 마커들은 향후 갓의 디지털 육종에 활용할 수 있으리라 전망한다.

본 연구에서는 B. juncea DH 계통 간의 F₁을 이용하여 소포자 배양을 수행하였다. F₁의 모본은 안토시아닌 비율이 높고 GSL 함량이 높으며, 부본의 경우 잎이 많은 특징을 가지는 계통을 선발하였다. 소포자 배양 결과 총 bud 수, 발생한 배아 수 그리고 bud 당 발생한 배아 수는 각각 2,010, 15,526 그리고 7.62이었다. 발생한 배아에서 유래한 반수체 식물을 배가반수체(AABB)로 배수화 시키기 위해 콜히친을 처리하였다. 그 결과 전체 218개의 재분화된 식물 중 149개 식물이 복이배체화 되어 68.3%로 배수화가 되는 것을 확인하였다. 이들 중 종자 채종 및 수확을 마친 117개 개체를 선발하였고, 포장에 전개하여 표현형 분석하였다. 잎 색, 잎 길이 및 기타 농업적 특성들은 모본과 부본의 대립 형질들의 재조합으로 인해 다양한 모습을 보였다. GSL 함량은 최대 29.27 μmol/g dry weight부터 가장 낮은 값은 6.39 μmol/g dry weight까지 기존 양친의 범위를 넘어서는 값을 보였다. GSL의 구성은 대부분 지방족(aliphatic)이었으며, 지방족 중에서도 시니그린(sinigrin)이 전체 함량의 약 89%를 차지하였다. 이렇게 확보된 DH 유전 집단은 향후 기능성 갓 자원을 육종하기 위한 소재로써 사용될 수 있다. 또한 추가적인 유전체 분석을 통해 주요 농업형질에 영향을 미치는 QTL 영역를 탐색하는 자료로 사용할 수 있을 것이다. 특히 전체 집단의 분석된 GSL 함량을 활용하여, GSL 생합성에 관련된 주요 유전자를 탐색할 수 있을 것이다. 이를 통해 개발된 마커는 향후 고부가가치 갓 자원 육종에 이용될 수 있다고 사료된다.

본문의 Supplementary Figs. 1-3은 한국육종학회지 홈페이지에서 확인할 수 있습니다.

본 결과물은 농촌진흥청 연구사업(과제 번호: PJ01673702)의 지원으로 이루어진 것임.