배추(Brassica rapa L.)는 호냉성 십자화과 채소로 한국 대표 전통음식인 김치의 가장 핵심적인 재료이다. 2023년도 가을배추의 재배면적은 13,152 ha, 가을배추 생산량은 124만 2천톤으로 확인되었으며 2022년도 기준 1인당 소비량이 약 52.0 kg의 달하여 한국인이 섭취하는 채소 중 가장 높은 비중을 차지하는 채소이기도 하다(MAFRA 2023, Statistics Korea 2023). 소포자 배양 기술은 1980년대부터 채소 육종에 다양하게 활용된 육종 기술로 단기간에 순계 고정계통(Double haploid)을 만들어낼 수 있다는 장점이 있어 육종에 다양하게 활용되었다. 이 기술은 십자화과 중 유채에서 최초로 성공하였으며(Lichter 1982), 현재 김치에 활용되는 결구배추는 1989년에 소포자 배양기술이 확립되어 다양한 고순도 계통 개발에 이용되었으며 2014년도에는 유색배추에 대한 소포자 배양 또한 시도된 바 있다(Chuong & Beversdorf 1985, Lee et al. 2014, Sato et al. 1989). 마찬가지로 십자화과 채소인 브로콜리(Brassica oleracea var. italica)가 소포자 배양에 성공하였고(Takahata & Keller 1991), 순무(Brassica rapa)와 청경채(Brassica campestris ssp. Chinensis)에서도 이어 성공한 사례가 있다(Burnett et al. 1992, Cao et al. 1994). 소포자 배양의 효율은 배양조건(배지, 온도, 열처리 조건 등), 배양재료(식물자원), 화뢰 크기 등에 영향을 많이 받으며 소포자 배양을 하기 전 해당 식물 재료에 대한 최적의 조건을 찾는 것이 중요하다. 소포자 배양은 전문적인 조직배양기술이 필요한 데다 사용하는 품종에 따라서도 결과가 크게 달라 각각의 작물과 품종에 적합한 방법을 매번 확립해야 하는 단점이 있다(Ferrie et al. 1995, Ferrie & Keller 1995).

소포자 배양을 효율적으로 하기 위해서는 배 발생이 가능한 소포자를 포함하고 있는 화뢰의 크기를 정확하게 선발하고 동정하는 것이 필요하다. 현재까지는 화뢰의 크기, 약과 주두의 비율에 따른 기준으로 소포자 분리 시기를 결정하였으나 이는 소수 품종에만 적용 가능하였다(Chun et al. 2011, Na et al. 2011a, 2011b).

그 밖에 여러 식물들의 사례에서 소포자 유래 배 발생에 적합한 소포자의 발육 단계가 1핵성 말기 또는 2핵성 초기가 적합하다는 보고가 있었다(Barro & Martin. 1999, Telmer et al. 1992, Wong et al. 1996, Zaki & Dickinson. 1990). 그러나 이는 절대적인 기준이 아니며 종이나 품종 및 계통 간에도 많은 차이가 나타난다. 2014년도 흑겨자(Brassica nigra)를 이용한 연구에서 꽃봉오리 크기가 약 2 mm~2.5 mm 크기인 후기 1핵성 단계가 소포자 배양 효율이 가장 높았다는 연구결과가 있었다(Gu et al. 2014). 또한 브로콜리(Brassica oleracea)에서도 유사한 연구가 진행된 바 있다(Takahata & Keller 1991).

소포자 유래 배 발생이 되지 않은 품종들의 근본적인 원인을 구명하기 위해서는 품종 및 계통과 생육 시기에 따른 소포자의 발육 단계, 그리고 그에 따른 소포자 배 발생 효율을 비교하는 연구가 1차적으로 필요하다(Jo et al. 2012, Kim et al. 2012, Park et al. 2006, Park et al. 2017). 배추과 식물 중 브로콜리에서 품종의 정 유전자형이 소포자 배 발생에 영향을 준다는 것을 확인하였으며(Shumilina et al. 2020), 콜리플라워(Brassica oleracea var. botrytis)에서 30종에 대한 다양한 유전자형의 소포자 효율 차이를 분석한 논문이 발표된 바가 있다(Bhatia et al. 2017). 무(Raphanus sativus L.)의 소포자에서 배 형성에 영향을 미치는 요인을 조사하기 위해 11개의 서로 다른 유전자형에 대한 배 발생을 분석하였고 최적의 배양시기가 유전자형에 따라 다름을 확인하였다(Takahata et al. 1996). 또한 2022년에는 무 23개의 유전자형을 가진 자원의 소포자 배양에 영향을 미치는 요인들을 분석한 바도 있다(Chen et al. 2022). 고추(Capsicum annuum L.)에서도 50개의 자원에 대한 마찬가지의 연구 결과가 있다(Cheng et al. 2013). 특히 순무에서 진행된 연구결과는 동일한 화분 발달 단계에서 유전자형 하나만 변수로 하여 배 발생 효율과 식물 유전자형과의 밀접한 관계를 설명한다(Shumilina et al. 2020). 5개의 배추속(Brassica rapa, Brassica oleifera, Brassica niposinica, Brassica perviridis, Brassica broccoletto)에서 소포자 배양 조건 차이를 연구한 사례도 있다(Takahashi et al. 2012). 십자화과 채소인 순무유채(Brassica rapa L. var. oleifera)에서도 17개의 품종을 이용하여 유사한 연구결과를 확보한 바 있으며(Ferrie et al. 1995), 케일과 갓에서도 각각 29개, 11개의 유전자형을 가진 자원에 맞춤 배양 조건을 규명하여 유전자형에 따른 소포자 배양 효율을 조정한 연구가 있다(Chu et al. 2020, Zhang et al. 2008).

본 연구는 배추의 소포자 배양 효율성에 영향을 미치는 주요 요인을 규명하고자 하였다. 배추의 다양한 유전자형에서 소포자 배양 효율성에 영향을 미치는 여러 요인을 조사하고자 하였으며, 특히 꽃가루 크기와 유전자형 간의 관계에 초점을 맞추었다. 서로 다른 유전자형의 배추 자원(국립원예특작과학원 육성자원)을 이용하여 소포자 유래 배 발생 효율을 비교하였고 이를 통해 유전자형과 화분발달 단계가 소포자 효율에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 소포자 배 발생 효율이 가장 높았던 육성계통인 원교20044호의 화뢰 크기에 따른 배 발생 효율을 광학 현미경을 통해 자세히 관찰하였으며 이를 통해 소포자 배양 효율에서 가장 주요한 요인을 확인하고자 하였다. 이 연구는 배추 소포자 배양을 위한 주요 요인들의 조건을 확립하여 더 효율적인 육종 기술 개발에 기여하고자 한다.

배추 식물체 확보 및 소포자 재료 준비

본 연구에는 원예원(국립원예특작과학원) 육성계통 4종을 이용하였다. 4종의 자원들은 원예원에서 소포자 배양을 통해 육성된 원교20039호(Wonkyo20039ho), 원교20045호(Wonkyo20045ho), 원교20044호(Wonkyo20045ho), 원교20050호이다. 원교20039호는 소형의 결구배추로 숙기가 빠르며 뿌리혹병 저항성을 보이는 자원이다. 원교20044호는 진한 귤색의 속잎을 가진 소형 배추이고, 원교20045호는 역시나 숙기가 빠르며 중도 이상의 뿌리혹병 저항성을 보이는 소형 결구배추이다. 원교 20050호는 글루코시놀레이트 고함량의 두꺼운 녹색 잎의 반결구 배추이다(Fig. 1, Table 1). 배추종자는 72공 트레이에 파종 후 국립원예특작과학원 채소온실(완주군 이서면)에서 키워졌다. 채소온실의 환경조건은 온도는 21~24℃, 습도는 40~60%로 유지되었으며 2023년 1월~3월동안 실험하였다. 본엽이 4장 이상 출연한 개체들은 춘화처리실(6~10℃, 18 hr 광조건)에서 45일~60일간 저온처리를 하고 화분에 정식하였다. 정상적인 생육 과정을 거쳐 개화가 시작된 식물체의 꽃봉오리(화뢰)를 선발하여 소포자 배양에 사용하였다.

Table 1

The list of the Chinese cabbage plant materials.

	Characteristic
Wonkyo20039ho	Yellow inner leaf, firm and round shaped small sized head, Clubroot race 4 resistance, early maturing
Wonkyo20044ho	Deep yellow-light orange colored inner leaves, deep green outer leaves. half opened head type
Wonkyo20045ho	Light yellow colored inner leaves, deep green outer leaves, small·firm and cabbage liked head, small outer leaf size, moderate Clubroot race 4 resistance, early maturing, fast flowering
Wonkyo20050ho	Deep green thick leaves, open head type, low total leaf numbers, high glucosinolates contents

Fig. 1. The Chinese cabbage plant materials used for the microspore embryogenesis.

배추 소포자 배양

배추 어린 꽃봉오리는 2-3 mm 크기의 것을 선별하여 자원 별로 30개씩 거즈로 싸서 소독하였다. 소독은 차아염소산나트륨(2%) 용액에 15분간 침지 후 꺼냈으며, 이후 소독을 위해서 멸균수로 3분간 침지 후 꺼내어 새로운 멸균수에 3분간 침지하는 과정을 3회 실시하였다. 배양을 위한 꽃봉오리의 준비는 1×NLN (Nitsch & Nitsch 1967, Lichter 1982) 배지를 소량 붓고 막자 사발로 갈아 45 ㎛체로 거른 후 NLN배지를 부어 30 mL로 부피를 맞추어 원심분리하여(30℃, 24시간), 암배양(25℃, 14일) 후 명배양(25℃, 75~80 rmp 진탕배양)하며 배 발생 여부를 조사하였다(Table 2). 배지의 조성은 1/2×NLN과 1/2×NLN with Vit.을 섞은 후 AgNO3 1 mg/L를 첨가한 이후 Sucrose의 농도를 13%로 맞춘 기본 배지와 NAA 0.05 mg/L와 BAP 0.05 mg/L를 첨가한 호르몬 배지를 이용하였다(Jang et al. 2016, Jang et al. 2017). 순화는 배상체의 크기가 7 mm 정도로 자랐을 때 3% sucrose가 포함된 1/2 MS (Murashige & Skoog, Duchefa)고체배지로 옮겨주었다. 정상적인 식물체로 자랄 때 까지 2~4회의 계대 배양을 수행한 후 멸균된 토양에 정식하여 정상적인 식물체로 자랄 때까지 순화하였다(Figs. 2, 3).

Table 2

Culture Media ingredients usef for the microspore embryogenesis (1L).

	NLN	NLN-vit	Sucrose	AgNo3	Ca(NO3)2
Washing media	0.387 g	1.039 g	13%	-	0.5 g
NLN-10	0.387 g	1.039 g	13%	1 mg	0.5 g
	MS (Murashige and Skoog medium)		Sucrose	Gelite
Shooting Medium	4.4 g		30 g	4 g

Fig. 2. The microspore embryogenesis scheme of Chinese cabbage.

Fig. 3. The picture of each microspore embryogenesis step of Chinese cabbage.

화뢰 크기에 따른 배발생 효율 비교 연구

가장 배 발생 효율이 높았던 원교20044호 식물체를 춘화처리를 통해 꽃대가 유도한 후 식물체들의 꽃봉오리를 크기별로 나누어 채취하였다. 꽃봉오리는 봉오리 크기가 2~3 mm, 4~5 mm와 6~7 mm로 나누어 자로 크기를 재어 크기별로 분류하였으며 그룹별로 40개의 꽃봉오리를 채취하여 소포자 분리를 진행하였으며 약 10개 정도의 꽃봉오리는 복합광학현미경 관찰을 위한 시료로 사용되었다. 꽃봉오리의 소독은 차아염소산나트륨(2%) 용액에 15분간 침지하였으며 멸균수로 3분간 침지하였다. Washing 과정은 3회 실시하였다. 배양을 위한 화뢰의 준비는 1×NLN (Lichter 1982, Nitsch & Nitsch 1967) 배지를 소량 붓고 막자 사발로 갈아 45 ㎛체로 거른 후 NLN배지를 부어 30 mL로 부피를 맞추어 원심분리하여(30℃, 24시간), 암배양(25℃, 14일) 후 명배양(25℃, 75~80 rmp 진탕배양)하며 배 발생 여부를 조사하였고 소포자 크기별 배 발생 양상의 차이를 확인하였다.

복합광학현미경을 이용한 해부학적 관찰

배추 재료 4점(원교20044호, 원교20050호, 원교20045호, 원교20039호)의 꽃봉오리로부터 채취한 소포자는 조직 절편을 채취하여 시료 고정을 위해 2.5% glutaraldehyde에 4시간 이상 진공 처리 후 4℃, 48시간 이상 냉장 보관하였다. 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2)로 15분 간격으로 3회 세척한 후 ethanol series (40%, 60%, 80%, 90%, 95% 100% ethanol)로 각각 30분씩 그리고 100% ethanol로 45분간 3회 탈수하여 48시간 이상 냉장 보관 후 Historesin을 매개로 60℃에서 중합하여 시료 블록을 제조하였다. 각 품종별, 시기별 5개 이상의 시료 블록을 초미세절단기(Leica, UC 7, 독일)를 이용, 3.0 um 두께로 40개 이상의 절편을 획득한 후 24시간 이상 건조 후 세포벽의 구성 성분인 다당류 검경을 위해 1% periodic acid (w/v) 30분, Schiffs reagent 40분, 1.5% sodium bisulfite (w/v)로 35분으로 P.A.S. (붉은 색 발색) 염색 후 흐르는 물에 30분 이상 세척 후 5시간 이상 건조 후 복합광학현미경(Carl Zeiss, Axioscope2, 독일)으로 검경하였다. 현미경을 통해 관찰한 배추 화분 및 소포자 발달단계는 다음의 논문들을 참고하여 분석하였다(Parra-Vega et al. 2015, Sánchez-Díaz et al. 2013, Twell et al. 1998, Yao et al. 2018).

배추 계통별 소포자 유래 배 발생 차이 분석

소포자 배양체 발생 정도는 유전자형에 따라 유의한 차이를 나타냈다. 원교20044호는 가장 높은 배 발생률을 보였으며, 원교20050호는 상대적으로 낮은 효율을 보였다. 원교20045호는 중간 정도의 효율을 보였으며, 원교20039호는 배 발생이 거의 이루어지지 않았다. 각 식물체의 배 발생 평균을 살펴보면, 원교20044호의 경우, 화뢰 당 평균 680개의 배 발생이 관찰되어 가장 높은 효율을 보였다. 이는 해당 유전자형이 주어진 소포자 배양 조건에 가장 적합함을 시사한다. 반면, 원교20050호는 화뢰 당 평균 97개의 배 발생만을 보였으며, 배 발생 효율이 낮았다. 원교20045호는 화뢰 당 평균 203개의 배 발생을 보였으며, 원교20039호는 화뢰 당 평균 7개의 배 발생이 관찰되어 배양 효율이 가장 낮은 결과를 보였다(Fig. 4). 자엽형 배가 발생한 원교20044호 소포자 배양 결과는 Fig. 5에 나와있다. 배 발생까지 소요되는 시간도 유전자형에 따라 차이를 보였다. 배 발생 효율이 가장 높은 원교20044호는 대부분의 실험에서 7일에서 10일 사이에 배가 발생한 반면, 나머지 계통들은 평균적으로 2주 정도의 시간이 소요되었다. 이러한 결과는 유전자형이 소포자 배양체의 발생 속도 및 효율에 중요한 영향을 미친다는 것을 보여준다.

Fig. 4. Different efficiency of microspore embryogenesis of each accession.

Fig. 5. The picture of embryos generated by Wonkyo 20044ho microspore.

배추 계통에 따른 소포자의 현미경 해부학적 분석

복합광학현미경 관찰을 통해 각 자원의 화분 발달 단계를 분석한 결과, 외부에서 추정한 성숙 시기와 실제 화분 발달 단계 간에 차이가 있음을 확인하였다(Fig. 6). 현미경 관찰에 사용되는 시료의 어느 부분이 절단되느냐에 따라 실제 보여지는 결과에 영향을 미칠 수 있기에 최소 한 자원 당 3점의 시료를 준비하였으며 봄과 가을 2회에 걸쳐 반복 실험하였다. 원교20039호는 정상적인 화분 발달 단계를 보여, 액포 형성 및 화분관핵과 정핵의 분리 단계가 명확히 관찰되었다. 반면, 원교20044호와 원교20050호는 화분 내부 구조가 기형적으로 형성되었으며, 발달 단계가 매우 초기 단계에 머물러 있는 것으로 확인되었다. 복합광학현미경에서 확보한 이미지를 자세히 분석해보면 원교20044호와 20050호의 경우 소포자 형태가 찌끄러진 경우가 많고 정상적이지 않은 형태가 자주 보였다. 이는 반복실험에서도 유사한 결과를 보였다. 일부 양극화 중인 소포자도 2개의 자원에서 확인되었다. 원교20039호의 경우 1핵성기와 2핵성기 사이 단계로 보였으며 뚜렷한 소포자를 확인할 수가 있었다. 일반적으로 소포자 배양 효율이 높다고 밝혀진 1핵성기 후기~2핵성기 초기 단계를 확실하게 보인 자원은 원교20039호였으나 해당 자원의 소포자 배 발생 효율은 가장 낮은 것으로 확인되어 소포자 효율에 유전자형이 화분 발달 단계보다 더 결정적인 역할을 하는 것으로 추정된다.

Fig. 6. A. The expected stage of the pollen development using the microscope image. B. The different microspore shape and developmental stage of the three Chinese cabbage accessions observed by light microscope.

소화뢰의 크기에 따른 소포자의 발달 단계

배양 효율이 가장 높았던 원교20044호를 대상으로 화분 발달 단계와 배양 효율 간의 관계를 분석하기 위해, 꽃봉오리 크기에 따라 샘플을 세 단계로 나누어 실험을 진행하였다(Fig. 7). 현미경을 통하여 가시적으로 확인이 되는 배의 개수를 계산하였으며 실험 결과, 꽃봉오리 크기가 2~3 mm인 실험군에서는 한 배지에서 12~13개 정도의 배가 발생되었고, 꽃봉오리 크기가 4~5 mm인 실험군에서는 배지당 16~17개의 배를 확인할 수 있었다. 꽃봉오리 크기가 6~7 mm인 실험군에서도 배지당 16~17개의 배가 발생하였다(Fig. 8).

Fig. 7. Size of the harvested buds (Wongyo20044ho). Three sized (2~3, 4~5, 6~7) buds were collected for the microspore embryogenesis.

Fig. 8. Picture of the embryos derived from different sized bud of Wonkyo20044ho.

전체적으로, 화뢰의 크기에 따른 소포자 배양 시 배 발생 개수는 꽃봉오리 크기 별로 1개에서 5개 정도의 차이를 보였다. 결론적으로 이 3개의 꽃봉오리 차이에 따른 실험군에서는 배 발생 효율이 크게 차이 나지 않음을 확인하였다. 복합광학현미경 관찰을 통해 채취한 소포자 크기에 따른 화분발달단계를 분석하였다(Fig. 9). 채취한 약의 크기가 2~3 mm일 경우, 약 내부 소포자낭에 따라 화분(Pollen) 단계가 많이 보이는 소포자낭과 소포자(microspore) 단계가 주로 보이는 소포자낭이 나뉘어짐을 확인하였다. 채취한 약의 크기가 4~5 mm일 경우, 촬영한 현미경 사진 결과에서 약 내부 소포자낭 내부가 뚜렷하게 보이진 않으나 2핵성기 양극화되고 있는 소포자 단계가 주로 보임을 확인할 수 있었으며, 채취한 약의 크기가 6~7 mm일 경우 소포자낭 대부분에 부분에서 화분 단계의 이른 이미지를 많이 확인할 수 있었다. 광학현미경 이미지를 전체적으로 분석하면 성숙한 화분 단계와 1핵성기, 양극화 중인 2핵성기 소포자 단계가 섞여있었다. 결론적으로 소포자와 화분의 발달 단계 정도가 소포자 배 발생 효율에 크게 영향을 주지 않았음을 확인하였으며 이는 1핵성기~2핵성기 소포자 단계에서 소포자를 분리하는 것이 항상 최적의 단계가 아닐 수 있음을 의미한다. 자원마다 적합한 소포자 단계가 다른 현상 또한 자원의 유전자형이 소포자 배양 효율에 얼마나 절대적인 요소인지 잘 설명한다. 유전자형이 소포자 배양 효율에 영향을 미치는 부분은 앞서 기술한 것처럼 다양한 논문 사례가 있으나 정확히 어떠한 유전자가 이 과정에 관여하는지는 명확히 알려진 바가 없다. 하지만 최근 연구에서 후보로 예측되는 유전자에 대한 연구가 발표되었다. Defective kernel 1 (dek1) (Ji et al. 2023), somatic embryogenesis-related kinase (serk1) (Chen et al. 2022) 등이 그 유전자들이다. 또한 한 연구결과에서는 소포자 배양 과정에서 스트레스 대응 관련 유전자가 영향을 줄 수 있다는 근거를 확인하였다(Camacho-Fernández et al. 2024). 고추에서도 관련된 QTL과 유전자를 찾은려는 시도가 있었으며(Bai et al. 2023), 유채에서 소포자 각 발달단계에 따른 유전자 발현 분석을 통해 BnSERK1와 BnSERK2 2개의 인자가 소포자를 이용한 배 발생과 재분화에 영향을 미친다는 것을 확인하였다(Ahmadi et al. 2016, Tsuwamoto et al. 2007).

Fig. 9. The Wonkyo20044ho pollen observed by light microscope.

이러한 연구결과를 토대로 보면 배추 작물의 경우도 품종이나 계통이 가진 유전자형에 따라 최적의 화분/소포자 발달 단계가 다를 수도 있으며 소포자 배 발생 효율의 큰 편차를 설명할 수 있다. 향후 배추 주요 자원별로 소포자 배양 효율을 극대화할 수 있는 최적의 조건을 확립하기 위해서는 보다 다양한 배추 자원을 이용하여 배 발생 효율, 배상체 확보 효율과 각 배추 자원의 유전자형간의 연관관계 분석 등이 진행되어야 할 것이다.

본 연구 결과는 이 연구는 배추(Brassica rapa)의 소포자 배양 효율에 영향을 미치는 중요한 요소들을 찾는 것을 목표로 한다. 이 연구에서는 여러 배추 유전자형에서 소포자 배양이 얼마나 잘 되는지에 영향을 미치는 요인들을 조사하였다. 특히, 꽃가루 크기와 배추 유전자형 차이에 초점을 맞췄다. 연구에는 세 가지 다른 배추 종류를 사용했다. 먼저, 각 배추 종류의 배발생 효율을 비교하여 높은, 중간, 낮은 효율을 보이는 세 가지 종류의 배추자원를 선택했다. 꽃봉오리를 수확해 광학 현미경으로 꽃가루 상태를 조사하였으며 예상외로, 가장 높은 효율을 보인 원교20044호(Wonkyo20044ho)는 비정상적인 형태의 소포자와 화분 형태를 보이는 데에 비해, 가장 낮은 효율을 보인 원교2039호(Wonkyo20039ho)는 정상적인 형태의 화분 형태를 가지고 있었다. 추가 실험에서 원교20044호의 다양한 크기의 꽃봉오리를 수확해 배발생 차이를 관찰하고 현미경으로 분석했다. 결과에 따르면 이 배추 자원의 경우 거의 모든 단계의 꽃가루가 소포자 배양에 적합하다는 것을 보여주었다. 이는 자원의 특이적인 유전자형이 꽃가루의 발달 단계보다 소포자 배양 효율에 더 중요한 비중을 차지함을 시사한다.

본 연구는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 기관고유사업(소포자 배양 기술을 이용한 바이러스 저항성 고추 및 내서성, 기능성 배추, 무 신육종소재 개발(PJ016662))의 지원으로 수행되었습니다.