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Anticipated Polymorphic SSRs and Their Application Based on Next Generation Sequencing of Prunus Persica
복숭아 NGS 분석에 의한 다형성 SSR 마커 개발과 활용
Korean J. Breed. Sci. 2021;53(4):350-360
Published online December 1, 2021
© 2021 Korean Society of Breeding Science.

Jung Sun Kim1*, Yoon Suk Ku1, Sin-Gi Park2, Se Hee Kim3, Hyun Woo Park1, and So Youn Won1
김정선1*⋅구윤숙1⋅박신기2⋅김세희3⋅박현우1⋅원소윤1

1Genomics Division, Department of Agricultural Biotechnology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, JeonJu 54874, Republic of Korea
2Bioinformatics Team of Theragene Etex Institute, Suwon 16229, Republic of Korea
3Fruit Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Rural Development Administration, Wanju-gun, 55365, Republic of Korea
1농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부 유전체과, 2테라젠이텍스 연구소 생물정보학팀, 3농촌진흥청 국립원예특작과학원 원예작물부 과수과
Correspondence to: (E-mail: jsnkim@korea.kr, Tel: +82-63-238-4559, Fax: +82-67-238-4552)
Received July 21, 2021; Revised September 30, 2021; Accepted September 30, 2021.
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Prunus persica “Mihong” cultivar is a domesticated white peach that was generated from the crossing between “Yumyeong” and “Chiyomaru” cultivars in the Republic of Korea in 1995. We launched “Mihong” genome sequencing in 2018 and “Mihong” reached to 200 scaffold and 241 Mb sequences using long-read sequencing and Hi-C technology. F1 populations of ”Kawanakajima Hakuto,” “Mihong,” “Changhowon Hwangdo,” and “Yumi” were developed in NIHHS. These four cultivars were sequenced and assembled using the SOAPdenovo version 2.04. First, we surveyed the SSRs in “Mihong” assembly sequences and extracted the ±300 bp flanking sequences containing SSRs. Second, the assembly sequences of three cultivars were aligned and mapped against “Mihong” ±300 bp flanking sequences using BLASTn (version 2.2.29+). We anticipated the differential length in SSRs among the four cultivars. We sorted the primers with a standard deviation over 4.5 (STEV > 4.5) among the four cultivars. In addition, we surveyed the primers having difference in over 10 bp with “Kawanakajima Hakuto” and “Mihong” for polymorphic markers in the mapping population. All primer pairs were designed to generate amplicons of 150-200 bp in coating SSR regions using primer3 (version 3-2.2.3). We selected 260 SSR markers with a physical distance of average per 1 Mb. These SSR markers accounted for 74% polymorphism in the four genotypes. Finally, a F1 population of “Kawanakajima Hakuto” and “Mihong” covered 884.5 cM with 465 SNPs and 86 SSRs and this genetic map matched correctly to the HI-C pseudomolecule of P. persica.
Keywords : peach, Prunus persica, SSR markers, genetic map
서 언

복숭아가 속한 장미과는 비교적 큰 속씨식물로서 3,000종, 3개 아종, 16족 및 88~100속으로 분류한다(Hummer & Janick 2009). 복숭아(Prunus persica, n=8)는 장미과(Rosaceae) 벚나무아과(Amygdaloideae) 편도족(Amygdalea) 자두속(Prunus)에 속하는 과수종으로(Xiang et al. 2016), 세계에서 사과와 배에 이어 생산량이 높은 온대 낙엽성 작목이다. 복숭아는 사과와 배보다 유전적 변이가 적고 조기 결실 및 자가수정이 가능하여 초기부터 유전 양식에 대한 연구가 잘 이루어져 왔다(Monet et al. 1996). 복숭아 육종은 넓은 재배지역과 비교적 짧은 2~년의 유년기를 가지므로 교잡이 용이하여 과수 육종이 성공적으로 이루어져 왔다(Cho et al. 2015).

장미과에는 과실, 견과류, 장식용 화훼, 아로마, 허브 등이 포함된 묘목에 속한다. 과실류는 사과, 딸기, 복숭아, 배, 자두, 아몬드, 라스베리, 시큼한 체리와 달콤 체리 등이 있다. 장미과 중 유전체 염기서열이 분석된 작목은 반수체(haploid, n)의 수가 가장 작은 야생 딸기와 장미(n=7), 자두, 살구, 체리류(n=8) 등 7~8개를 가진다. 복숭아(265 Mb)는 작은 유전체 크기를 가지고 있을 뿐 아니라 장미과 원시조상(n=9)으로부터 추가적인 유전체중복(Whole genome duplication, WGD) 없이 염색체의 융합 혹은 결실되는 과정을 통해 8개 염색체쌍을 가지고 있다(The International Peach Genome Initiative 2013, Verde et al. 2017). 이에 반해 최근 유전체 중복을 가진 사과, 배의 염색체는 1개쌍을 갖고 있고(Soundararajan et al. 2019), 사과(742.3 Mb, Valesco et al. 2010, Daccord et al. 2017)와 중국배(527.3 Mb, Wu et al. 2013), 유럽배(600 Mb, Chagne´ et al. 2014) 등의 유전체 해독연구가 보고된 바 있다.

육종과정에서 식물 유엽기에서 원하는 유전형질을 가진 식물체를 조기선발할 수 있는 분자마커이용선발법(Marker-Assisted Selection, MAS)이 중요시되고 있고(Bernacchi et al. 1998). 이러한 선발에 필요한 분자마커 개발과, 유전자 연관지도를 작성하여 양적형질 유전자좌(quantitative trait loci, QTLs)를 확인하는 연구는 복숭아 육종연구를 위해서도 중요하다. 분자마커는 표현형의 특징을 비교하는 형태마커(morphological marker)와는 다르게 DNA 염기서열 차이를 기반으로 하기 때문에 많은 양의 시료 분석이 가능할 뿐만 아니라, 작물의 생육 변화 및 환경적 요인에 크게 영향을 받지 않는다(Collard et al. 2005).

Simple Sequence repeat (SSR)은 한 개에서 여섯 개의 염기 단위가 반복으로 분포하는 short tandem repeats (STRs)와 variable number tandem repeats (VNTRs) 또는 microsatellites 마커로 알려져 있다. Microsatellites는 5와 40 base pair (bp) 반복 단위의 다양한 변이로서 완전하거나 완전하지 않은 형태로 구분한다. 리핏 단위가 시작부터 마지막까지 배열된 경우와 리핏 단위내에 삽입, 결손, 치환과 같은 변이가 있는 경우가 있다(Cantarella & D’Agostino 2015). SSRs은 반복서열(repeat) 단위의 높은 수준의 변이를 보여서 분자마커로서의 효용성이 높다. 또한 공우성 유전 방식을 보일 뿐 아니라 이런 효용성으로서 집단 유전지도의 구조(backbone) 역할을 하는 마커로 사용 가능하다. 반면 비교적 높은 개발 단가와 다양한 시퀀스 정보 부재, 기술적 어려움이 단점이었다(Yu et al. 2011).

Next-generation-sequencing (NGS)의 발달은 많은 유전자원에 대하여 SSRs, Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) 및 삽입/결손 변이, 목표로 하는 유전자 등 다양한 유전학적 재료들을 확보할 수 있게 하였다(Varshney et al. 2009). 딸기와 같이 육종 품종과 야생종간에 배수성이 다른 장미과 식물들은 레퍼런스 유전체를 확보하는 것이 유전학적으로 육종연구에 매우 중요한 핵심이 되기도 한다(Isobe et al. 2020). 또한 애기장대, 벼 등과 같이 염색체 수준의 유전체 해독되지 않은 작물이더라도, NGS 기술의 진화는 단거리 염기서열 분석을 가능하게 하였고, 이 들 서열에서 microsatellite들을 대량 개발 가능하게 하였다(Cantarella & D’Agostino 2015). 식물의 NGS 데이터 활용 새로운 SSR 마커 탐색(Taheri et al. 2018) 논문에서 다양한 NGS 플랫폼을 이용하여 콩과류, 배추속, 화본류 등에 대하여 SSR, EST-SSR, cDNA-SSR 마커들이 15~138,000개까지 탐색되었다고 보고하였다. 포스트다부처유전체프로젝트 2단계 과제로서 ‘미홍’ 복숭아 유전체를 장거리 서열기반과 Hi-C 물리지도 작성 기술을 이용하여 200개 스캐폴드, 241 Mb를 조립하였다. 본 연구에서는, 레퍼런스 유전체 서열을 진행하고 있는 ‘미홍(Mihong_MH)’과 우량 품종으로 많이 재배되고 있는 ‘천중도백도(Kawanakajima Hakuto_KH)’, ‘장호원황도(Changhowon Hwangdo_CH)’와 ‘유미(Yumi_YM)’ 복숭아들을 단거리 염기서열 분석한 후, 미홍 복숭아 서열과 비교하여 다형성 SSRs을 예측하였다. 복숭아 분리집단은 ‘천중도백도’를 모본으로 ‘미홍’을 부본으로 교잡한 73개 F1 개체들을 이용하였다. 조립된 200개 스캐폴드 시퀀스에 대하여 ‘천중도백도’ 유전체 서열을 비교 맵핑하고, 다형성이 예측되는 최소한 100 Kb에서 3 Mb 떨어진 마커들을 260개 선별하였고, GBS SNPs, SSRs 마커들에 대하여 유전지도를 작성하였다.

재료 및 방법

식물 재료

본 실험에서는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 제공받은 네 개의 복숭아 품종, 만생종인 ‘천중도백도(KH)’와 ‘장호원황도(CH)’ 극조생종인 ‘미홍(MH)’(Jun et al. 2007)과 조생종인 ‘유미(YM)’(Jun et al. 2013)를 이용하였다. 또한 분리집단은 만생종 ‘천중도백도’를 모본으로, 극조생종인 ‘미홍’을 부본으로 교잡한 F1 분리 집단 73개체를 이용하였다.

식물 Genomic DNA 추출

‘장호원황도’, ‘유미’, ‘천중도백도’, 3개 품종과 천중도백도와 미홍 교배집단 F1, 73 개체들의 꽃이 핀 후 20일 후의 어린잎을 채취하여 genomic DNA를 추출하였다. 액체질소를 이용하여 조직을 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)의 매뉴얼에 따라 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동하여 DNA를 확인하였고, Nanodrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 농도 및 순도를 확인하였다. 확인된 DNA들을 1 µL당 4 ng의 농도로 희석하여 4 µL를 PCR 분석에 이용하였다.

레퍼런스 ‘미홍’ SSR 프라이머 선발과 다형성 예측 SSR 프라이머 선발

‘미홍’ 복숭아 241.05 Mb 조립 시퀀스, 200개 스캐폴드 서열로부터, 단순반복염기서열이 2 개에서 10개 모티프를 가지는 78,209개 SSRs을 탐색하였다. 탐색된 SSRs 기반으로 양쪽말단 300 bp씩 부착한 서열들을 추출하였다. Primer3 프로그램(version3-2.2.3)을 사용하여 SSRs 반복서열이 포함된 증폭산물의 크기가 150~200 bp 사이에서 나올 수 있도록 프라이머를 설계하였다. 분리집단 모본친으로 이용한 ‘천중도백도’와 우리나라 중부지방에서 많이 재배되는 ‘장호원황도’와 대표적 조숙종인 ‘유미’ 등 3개의 복숭아에 대한 단거리 염기서열 분석에서 단거리 서열들을 Trimmomatic (version 0.3)에 의해 어댑터 트리밍과 error correction을 수행하고 SOAPdenovo (version 2.04)에 의해 컨티그를 조립하였다. 이렇게 조립된 3개 복숭아 품종 시퀀스를 ‘미홍’ 레퍼런스 서열과 BLASTn 상동성 분석하였다. ‘미홍’ 복숭아와 맵핑비교서열분석 시 SSRs 길이차이가 나는 영역을 선발하였다.

복숭아 SSR 프라이머 활용 PCR 분석

PCR 분석은 16 ng genomic DNA와 10 pmol/µL의 양방향 프라이머와 멸군수로 10 µL를 맞추고, 2배 농도의 TOPsimpleTMDyeMIX-nTaq (Taq DNA polymerase 0.2 U, dNTPs 0.4 mM, MgCl2 3 mM; Enzynomics, Daejeon, Korea)을 10 µL 넣은 조성액을, 반복 없이, 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation을 수행한 뒤, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건을 30회 반복하는 조건으로 수행하였다. 일부 primer의 경우 Tm 값에 따라 온도를 조정하였다. PCR 산물은 2.5~3% agarose gel을 만든 후, 1×TAE (Tris-Acetate EDTA) buffer내에서 80 V에 3시간 동안 전기영동 하여 양친과 분리집단 다양성을 탐색하였다.

분리비 판독 및 유전자 지도 작성

분리비는 헤테로 유전집단의 분리비에 맞도록 판독하였다. 모본(‘천중도백도’)과 부본(‘미홍’)의 대립 단편(allele) 증폭 양상에 따라 모본이 헤테로인 경우는 모본계 마커(lmxll), 부본이 헤테로인 경우에는 부본계 마커(nnxnp), 모본과 부본이 모두 헤테로인 경우에는 양친 헤테로 마커(hkxhk)로 구분하여 판독하였다. 본 연구에서 사용한 모든 마커들은 각 마커들이 만들어진 스캐폴드와 위치를 나타낼 수 있도록 명명하였다. 예를들어 SC_010_148마커는 ‘미홍’ 10번 스캐폴드 시퀀스의 148 Kb에서 만들어진 마커이다. SSR 마커들은 스캐폴드 위치 앞에 부착하였다. 즉 SSR_SC_010_395는 ‘미홍’ 복숭아 스캐폴드 10번 395 Kb에 있는 서열로부터 만들어진 SSR 마커이다. 유전자지도 작성은 JoinMap4.1 (Kyazma B.V., Wageningen, Netherlands)을 이용하였고, independence LOD값 2~10 조건과, 유사도 threshold는 0.95 이상으로 분석하였다. 맵핑 알고리즘은 ML (Maximum Likelihood) mapping을 활용하였고 Haldane’s function을 이용하여 third round까지 돌려서 모부본 consensus map을 Map Chart로 작성하였다.

결과 및 고찰

‘미홍’ 복숭아 유전체 분석 및 SSR 프라이머 제작

‘미홍’ 복숭아는 2018년부터 포스트다부처유전체프로젝트 2단계를 통해 장거리 서열 분석 기반에 Hi-C 조립을 추진하여 200개 스캐폴드, 241.05 Mb를 조립하였다. 조립된 시퀀스에서 단순반복염기서열(Simple sequence repeats, SSRs), 2 개부터 10개 반복인 78,208개가 예측되었다. 이러한 SSRs이 위치된 양 옆의 서열로부터 Primer3로 프라이머 디자인을 한 결과, 20,313개 프라이머쌍을 설계하였다(Table 1). SSR 반복서열이 AC/AG/AT/CG와 같은 di-nucleotide가 85.97%, AAT/AAG/AAC/ATG/AGT/AGG/AGC 등 tri-nucleotide가 10.80%로서, di-와 tri-nucleotide가 전체의 96.77%가 분포하였다. 이는 같은 장미과 유전체 속한 배(Lee et al. 2018)의 SSRs 프라이머와 비교해보면, 분포가 유사하지만 복숭아에서 탐색된 SSR 분포 개수와 프라이머쌍 개수의 비율이 더 높게 나타났다. 즉 조립크기에 대한 분포로 ‘미홍’ 복숭아 0.032, ‘원황’ 배 0.023개이었고, 프라이머쌍 설계도 ‘미홍’ 복숭아 25.97%, ‘원황’ 배 20.74%로서 복숭아 SSR 탐색 빈도수가 더 많았다. Illumina 2500 분석 플랫폼을 이용하여 복숭아 36개 시료에서 SSR을 탐색한 결과, 7,773개 유전자에 위치한 25,037개 SSRs 탐색을 보고하였다(Guan et al. 2019). 또한 복숭아와 같은 헤테로 작물인 선인장(Coleocephalocereus purpureus)에서 NGS 분석에 의한 SSR 마커 개발로서 14,769개 SSRs이 포함된 시퀀스를 확보되었다(Fraga et al. 2019).

Table 1

Classification of the simple repeat sequence types, frequencies and number of primers to two genomes of Prunus persica and Pyrus pyrifolia

Repeat-type Peach (‘Mihong’) Pear (‘Wonwhang’)
Frequencies Primer pairs Frequencies Primer pairs
Di-nucloetide 67,238 16,557 102,797 21,200
Tri-nucloetide 8,446 3,060 11,403 2,695
Tetra-nucloetide 1,567 451 2,991 458
Penta-nucloetide 597 110 454 71
Hexa-nucloetide 241 96 203 41
Hepta-nucloetide 67 20 137 8
Octa-nucloetide 42 15 16 3
Ennea-nucloetide 9 4 0 0
Deca-nucloetide 1 0 2 0
Total 78,208 20,313 118,003 24,476
Assembledgenome size (bp) 241,045,119 516,600,000


복숭아 3품종 염기서열 분석과 SSR 길이 다형성 마커 선발

원예특작과학원에서 제공 받은 세 개의 복숭아 품종, 만생종인 ‘천중도백도(KH)’와 ‘장호원황도(CH)’와 조생종인 ‘유미(YM)’(Jun et al. 2013)에 대하여 NGS 분석 장비(Illumina 4000)로 단거리 염기서열을 분석하였다. ‘유미’는 60.03 Gb (229X, ‘미홍’ 복숭아 예측 게놈 크기인 261.6 Mb에 대한), ‘천중도백도’는 51.18 Gb (195X), ‘장호원황도’는 60.38 Gb (231X) 단거리 염기서열 분석하였다(Table 2). 레퍼런스 복숭아 ‘미홍’에서 SSR 프라이머쌍이 설계된 SSRs이 있는 ±300 bp 영역에 대하여 3개의 복숭아 품종 시퀀스로 BLASTn 상동성 분석하였고, 비교된 SSR 길이의 다형성을 분석하였다. 4품종의 다형성이 예측된 프라이머쌍의 수는 2,430개 마커쌍이었다(Table 3). 비교한 네 종 복숭아들간의 표준편차(standard deviation, STDEV)를 조사하였고, 4.5 이상되는 521개 프라이머쌍을 탐색하였다. 본 연구에서 이용한 ‘천중도백도’와 ‘미홍’ 분리집단에 적용하기 위하여 521개 프라이머쌍이 증폭하는 서열들의 스캐폴드 위치에 대하여 300 Kb에서 1 Mb 떨어진 마커들을 선발하였다. 특히 프라이머쌍을 선발할 때, ‘미홍’ 레퍼런스와 ‘천중도백도’ 유전체의 예측되는 SSR 반복 수의 차이가 최소 10개 bp 이상 차이나는 프라이머쌍들로만 선발하였고, 최종 260개 프라머쌍을 결정하였다(Table 3, Supplementary Table 1). 이와 같은 High-through sequencing 기반 NGS 기술은 빠르고 효과적으로 DNA 마커 개발이 가능하였다. 이렇게 서열 비교를 통한 SSR 마커 개발 등은 유전자원 다양성 평가, 유전지도 작성 및 복숭아 분자 육종에 효율적임이 보고되었다(Guan et al. 2019). 또한 복숭아 적색 과육 품종인 ‘조생혈도’와 백색 과육 품종인 ‘미백도’ 유전자 발현 차를 보기 위하여 NGS 기술로 발현유전자들을 염기서열 분석하여, 72쌍의 SNP 분자표지를 선발하고, 적색 과육 품종 8개와 백색 과육 품종 24개를 구분할 수 있는 품종식별 SNP 마커 개발을 보고하였다(Kim et al. 2019).

Table 2

Reference (‘Mihong’) mapping results of NGS sequences of three peach cultivars

Cultivars Number of Base (bp) Number of Reads Mapping % to Reference genome Number of Mapped reads
‘Yumi’ 60,034,465,448 594,400,648 97.12% 579,083,849
‘Kawanakajima Hakuto’ 51,175,739,086 506,690,486 96.81% 492,092,032
‘Changhowon Hwangdo’ 60,377,393,778 597,795,978 96.92% 580,984,428

Table 3

Polymorphic SSR markers obtained by next generation sequencing of three cultivars compared to the reference sequence ‘Mohong’ of Prunus persica

Repeat-type SSR primer pairs Polymorphic SSR primer pairs in four cultivars Selected Polymorphic SSR primer pairs in four cultivars
Di-nucloetide 16,557 2,221 239
Tri-nucloetide 3,060 141 12
Tetra-nucloetide 451 32 1
Penta-nucloetide 110 9 0
Hexa-nucloetide 96 18 4
Hepta-nucloetide 20 4 2
Octa-nucloetide 15 4 2
Ennea-nucloetide 4 1 0
Deca-nucloetide 0 0 0
Total 20,313 2,430 260


복숭아 품종간 다형성 SSR 마커 및 분리집단 분리비 판독

4개 품종의 다형성을 분석하였다. PCR 산물을 2.5% agarose gel상에서 80 volt, 3시간 전기영동하고 이미지를 판독하였다(Fig. 1). 증폭이 잘 안되거나 희미하게 검출된 22개 마커가 있었다. 4 개 품종 모두 다형성이 없는 monomorphic 마커는 54개이었다. 184개 마커는 4개 품종 중 한 개 이상 다형성을 보였다. 분석에 이용한 260개 SSR 마커에 대한 70.77% 다형성이고, 증폭이 된 238개에 대한 77.3% 다형성이었다(Table 4). 다형성을 보인 SSR 마커 중에서는 di-nucleotide (nt)가 239개로서 92.7% (165/178)이었다. 이는 같은 장미과에 속한 과수내 중국배 레퍼런스 ‘당산슐리’ SSR마커 중에서 di-nt 다형성을 보인 93.7% (1,256/1,341)와 유사하였다(Chen et al. 2015). 그 밖에 hexa-nt로서 다형성을 보인 SSR 마커는 3종, 1.7%를 보여 높은 다형성을 보였다.

Table 4

PCR survey results on the six cultivars using 260 SSR markers of Prunus persica

PCR analysis in the six cultivars Number of SSR primers Ratio (%)
No amplicon 22 8.46
Monomorphic amplicon 54 20.77
Polymorphic at least in one cultivar 184 70.77
Total 260 100

Fig. 1. Results of amplified DNA polymorphism in four cultivars of Prunus persica. M, 1Kb DNA ladder; 1, ‘Kawanakajima Hakuto (KH)’; 2, ‘Mihong (MH)’; 3, ‘Changhowon Hwangdo (CH)’; 4, ‘Yumi (YM)’. These PCR products were amplified by 001 to 024 primer pairs.

본 연구에서 이용한 유전집단 ‘천중도백도’와 ‘미홍’ 간에 다형성을 보이는 마커는 146개로서, 증폭된 마커 대비 61% 다형성을 탐색할 수 있었다. 분리집단에 대하여 모본이 헤테로인 모본계 마커(lmxll) 56종, 부본이 헤테로인 부본계 마커(nnxnp) 40종과 모본과 부본이 모두 헤테로인 양친 헤테로 마커(hkxhk) 11종 등 107개 SSR 마커에 대한 분리비를 판독하였다. ‘천중도백도’와 ‘미홍’ 분리집단에 대한 GBS 분석을 통해 선발한 SNPs 마커 571개와 같이 총 678개 분리비에 대하여 JoinMap4.1 프로그램으로 연관도를 분석하였다. SNPs 마커 465종과 SSRs 마커 86종이 위치 분석되었다(Supplementary Table 2). 복숭아 염색체 8개에 대하여 551개 마커, 884.54 cM을 가진 유전지도를 작성하였다(Table 5). 이는 1 cM 당 0.62개 또는 조립 시퀀스 241.05 Mb에서 1 Mb 당 2.29개 loci가 위치한 것이다. 유전지도에 위치한 SSR 마커들은 파란색으로 하이라이트 하였다(Fig. 2). 마커 선발 과정에서 260개 SSR 마커는 복숭아 염색체 전체를 나타낼 수 있도록 물리적 거리를 고려하여 선발한 바 있었고, 예상대로 각 염색체 별로 고르게 분포하였다. Chr1번은 조립한 스캐폴드 15번이 맵핑되었고 그 길이가 47.9 Mb이었다.

Table 5

Integreated genetic map of Prunus persica

#Chr loci SNPs SSRs Genetic length (cM)
Chr1 90 71 19 148.50
Chr2 75 62 13 101.11
Chr3 63 55 8 110.74
Chr4 54 43 11 117.51
Chr5 49 43 6 66.11
Chr6 84 72 12 114.57
Chr7 40 31 9 90.79
Chr8 96 88 8 135.22
total 551 465 86 884.538

Fig. 2. Integrated genetic map constructed with 86 SSRs and unpublished 465 SNP markers of Prunus persica. SSR markers were highlighted with blue color. This genetic map was covered 884.5 cM.

복숭아 품종 판별에 활용 가능한 238개 SSR 마커

PCR 증폭이 확인된 238개 다형성 SSR 마커들은 예측되었던 SSR 길이의 차이가 커서 2.5% agarose gel상에서도 분리가 용이하였다. Fig. 1에서 보여진 11, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21번 프라이머쌍은 복숭아가 헤테로 유전형임에도 불구하고, 고정계통처럼 싱글밴드 다형성을 보였다. 그런데, 이 들 프라이머쌍으로 ‘천중도백도’와 ‘미홍’ 분리집단을 분석한 결과 Supplementary Fig. 1과 같은 부모계의 싱글밴드가 같이 증폭하는 동일 헤테로형 증폭 산물이 분석되어서 분리비로 활용할 수 없었다. 이렇게 품종간 서로 다른 크기로 증폭하는 10, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 20번 프라이머쌍은 유전집단의 연관마커 분석에는 적합하지는 않지만 품종을 구분하는 좋은 분자표지로 사용될 수 있으리라 예측한다. 또한 네 개 품종간에 그 다형성이 뚜렷하게 agarose gel상에서 분리되는 65, 67, 70, 84번 프라이머쌍들도 복숭아 품종 구분에 사용될 수 있는 유용한 마커가 되리라 판단할 수 있다. 증폭된 238개 SSR 길이 다형성 마커 분석 중 85, 138번 프라이머쌍과 같이 2~3개 밴드의 크기가 서로 다른 마커들은 다양한 복숭아 품종에서 그 차이가 검출될 수 있고, 품종 판별 마커로 사용될 수 있을 것이다. 이렇게 복숭아 품종 판별 마커로 사용 가능한 프라이머쌍들의 복숭아 네 개 품종들의 PCR 결과를 Fig. 3에 나타내었다.

Fig. 3. Results of four cultivars of Prunus persica using polymorphic SSR markers. M, 1 Kb DNA ladder; 1, ‘Kawanakajima Hakuto (KH)’; 2, ‘Mihong (MH)’; 3, ‘Changhowon Hwangdo (CH)’; 4, ‘Yumi (YM)’. These PCR products were amplified by 010, 011, 014, 015, 017, 018, 019, 020, 065, 067, 069, 070, 084, 085, 124, and 138 primer pairs.

같은 parentage를 갖는 복숭아 품종에 대한 염색체에 고르게 분포하는 260개 마커의 효용성

원예원에서 육성한 ‘미홍’, ‘유미’, ‘미스홍’, 및 ‘수미’ 복숭아는 같은 parentage 조합을 갖고 있다. 즉 평균 125.3일의 숙기를 가진 만생종 ‘유명’(‘Yumyeong’)과 평균 76.8일의 숙기를 가진 조생종 ‘찌요마루(Chiyomaru)’의 교잡종들이다(Jun et al. 2013). 본 연구에서 260개의 마커를 이용하여 같은 parentage 조합인 ‘미홍’과 ‘유미’ 복숭아를 분석한 결과, 219개 마커는 동일한 PCR 결과를 보였고, 41개 프라이머쌍에서 PCR 산물의 다형성이 나타났고, 그 다형성들을 보이는 마커들의 유전적 분포는 분산 분포보다는 수렴 분포를 보였다(Fig. 4, Supplementary Table 3). 이와 같이, 본 연구에서 개발한 260쌍 SSR 프라이머는, 같은 조합의 양친에서 육성한 우수 품종들의 표현차이를 분석하는데 활용할 수 있다. 또한 우수한 원예형질을 가지고 있는 품종들을 대상으로 숙기 형질에 연관된 마커 선발에도 활용될 수 있을 것이다.

Fig. 4. The polymorphic genomic regions between ‘Mihong’ and ‘Yumi’ with the same parentage and early ripening type cultivars.
적 요

‘미홍’ 복숭아는 ‘유명’과 ‘찌요마루’의 교잡종으로 1995년에 육성되었다. ‘미홍’ 복숭아를 장거리 염기서열 장비 및 Hi-C 물리지도 분석 기술을 이용하여 염기서열 분석하여 200개 스캐폴드, 241 Mb 유전체 시퀀스를 조립하였다. 원예특작과학원에서 육성한 두개의 F1 유전집단, ‘천중도백도’와 ‘미홍’ 및 ‘장호원황도’와 ‘유미’ 복숭아 교잡 분리집단을 분석하고자 ‘미홍’ 외 3 품종을 단거리 염기서열분석하고 SOAPdenovo (2.04) 프로그램으로 조립하였다. ‘미홍’ 유전체 서열에서 SSRs 포함된 ±300 bp 서열을 추출하고, 이 들 서열에 복숭아 3 품종을 맵핑하였다. SSRs이 포함된 영역에서 SSR 길이를 비교 분석하였고, 4개 품종의 표준편차를 분석하였다. 표준편차 4.5 이상이고 ‘천중도백도’와 ‘미홍’ SSR 길이차가 10 bp 넘는 영역을 구분하였다. 150~200 bp PCR 산물이 증폭되도록 프라이머3 (version 3-2.2.3) 프로그램으로 프라이머를 설계하였다. ‘미홍’ 복숭아 조립 시퀀스 기준 각각 1 Mb 떨어진 260개 쌍 프라이머를 설계하였다. 4개 품종에서 74%의 다형성이 분석되었고, ‘천중도백도’와 ‘미홍’ 복숭아 F1 분리집단 GSB 유전지도에 연계하여 465개 SNPs와 86개 SSRs 마커가 위치한 888.5 cM 유전지도가 작성되었다.

보충자료

본문의 Supplementary Tables 1-3과 Supplementary Fig. 1은 한국육종학회지 홈페이지에서 확인할 수 있습니다.

kjbs-53-4-350-supple.pdf
사 사

본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업 포스트게놈다부처유전체사업(세부과제번호 PJ01338101)의 지원에 의하여 수행되었습니다.

Supplementary information
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December 2021, 53 (4)
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