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Characterization of the RsMYB1 Promoter Induced by Various Abiotic Stresses
다양한 비생물적 스트레스에 의해 유도되는 RsMYB1 프로모터의 특성분석
Korean J. Breed. Sci. 2021;53(4):380-391
Published online December 1, 2021
© 2021 Korean Society of Breeding Science.

Da-Hye Kim1,2, Ju-Hee Yang2, JuHee Rhee2, Jong-Yeol Lee2*, and Sun-Hyung Lim1*
김다혜1,2⋅양주희2⋅이주희2⋅이종렬2*⋅임선형1*

1Division of Horticultural Biotechnology, School of Biotechnology, Hankyong National University, Anseong, 17579, Republic of Korea
2National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Jeonju 54874, Republic of Korea
1국립한경대학교 원예생명공학과, 2농촌진흥청 국립농업과학원
Correspondence to: Sun-Hyung Lim (E-mail: limsh2@hknu.ac.kr, Tel: +82-31-670-5105, Fax: +82-31-670-5109)
Jong-Yeol Lee (E-mail: jy0820@korea.kr, Tel: +82-63-238-4616, Fax: +82-63-238-4602)
Received September 6, 2021; Revised September 30, 2021; Accepted September 30, 2021.
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Plants grown under stress conditions generate excessive reactive oxygen species resulting in cell death. Therefore, plants activate the protection mechanism via antioxidant accumulation. Anthocyanins are flavonoid-derived secondary metabolites with high antioxidant properties. In this study, we analyzed and characterized the promoter region of RsMYB1, a positive regulator of anthocyanin biosynthesis. The RsMYB1 promoter was designed with four different fragment lengths (MP1, -1034; MP2, -830; MP3, -633; and MP4, -430 bp), and then each RsMYB1 promoter region was fused into a GUS gene for Arabidopsis transformation. The expression patterns of the RsMYB1 promoter constructs were analyzed at different developmental stages and under various abiotic stresses. The GUS expression pattern steadily increased with plant growth, and coincided with enzyme activity and a histochemical GUS assay. In response to drought, salt, sucrose, and low temperature, the GUS transcript level was highly expressed in MP4 in parallel with GUS enzyme activity. These assays indicated that the proximal region (-430 to -1 bp) of RsMYB1 was the core sequence that was induced by salt and low temperature. The expression level of RsMYB1 in the leaves of radish was highly activated and was consistent with the anthocyanin content under salt and low temperature conditions. These results suggest that induction of the RsMYB1 gene can activate the biosynthesis of anthocyanins, which are expected to help plants adapt to stress conditions due to their antioxidant activity.
Keywords : abiotic stress, anthocyanin, promoter, radish, RsMYB1
서 언

식물은 성장과 발달 동안 가뭄, 염분 그리고 저온과 같은 스트레스 환경에 노출되며, 이러한 상황에 적응하기 위해 다양한 스트레스 내성 메커니즘을 진화시켜 왔다. 스트레스 상황 속에서 엽록체, 미토콘드리아, 퍼옥시좀과 같은 다양한 세포내 소기관에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다(Baxter et al. 2014, Sandalio & Romero-Puertas 2015, Dietz et al. 2016, Huang et al. 2016). 식물체내에 생성된 활성산소종은 DNA를 손상시키며 세포사멸을 유도할 뿐만 아니라 정상적인 식물 성장을 방해한다(Huang et al. 2016). 모든 활성산소종의 기본이 되는 산소는 안정적이나, 식물대사에 영향을 주는 다양한 과정에 의하여 여러 식물 소기관에서 활성산소종으로 전환될 수 있다(Mittler 2017).

식물체내에서 생성된 활성산소종는 크게 효소적 및 비효소적 시스템에 의하여 제거된다. 효소적 시스템에는 대표적으로 초과 산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase, SOD), 아스코르브산 과산화효소(ascorbate peroxidase, APX), 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase, GPX)가 있다(Apel & Hirt 2004). 비효소적 시스템의 경우 플라보노이드, 글루타티온, 아스코르브산과 같은 항산화 물질이 활성산소종의 일종인 수산화 라디칼(hydroxyl radicals)과 일중항 산소를 제거하는 것으로 보고되었다(Gechev et al. 2006). 특히, 플라보노이드 계열 물질 중 하나인 안토시아닌은 UV로부터 식물을 보호하고 활성산소를 제거하는 등 다양한 방어 기작을 가진다(Pourcel et al. 2007, Mouradov & Spangenberg 2014, Xu et al. 2017). 안토시아닌 생합성은 다양한 전사인자에 의하여 조절되며, 이러한 전사인자들은 지베렐린, 앱시스산, 자스몬산, 에틸렌을 포함하는 식물 호르몬과 광, 당(sugar), 온도, 가뭄, 염, 탄소/질소비(C/N ratio) 등과 같은 환경적인 자극에 의해 유도되어 안토시아닌 생합성 경로를 조절한다(Xu et al. 2015). 에틸렌 반응 인자(etylene repsponse factor, ERF)는 식물 성장 및 안토시아닌 생합성을 포함한 다양한 스트레스 반응에서 중요한 역할을 한다(Mizoi et al. 2012). MdERF38은 안토시아닌 생합성의 양성조절자인 MdMYB1의 프로모터 영역에 결합하여 유전자의 발현을 유도하며, 가뭄 스트레스에 반응하여 안토시아닌 생합성을 촉진한다고 보고되었다(An et al. 2020). 또한 토마토와 양배추의 유식물체에 염분을 처리하여 안토시아닌의 생성이 유도되어 스트레스 조건에서 식물체를 보호하는 기작이 보고되었다(Eryılmaz 2006). 당은 광합성, 영양분 가용, 잎 노화 조절을 포함한 다양한 식물 발달 과정을 조절하고 식물의 성장을 자극하며, 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 유도하여 색소 생성을 야기시킨다(Bleecker & Patterson 1997, Corbesier et al. 1998, Smeekens 2000, Weiss 2000, Rolland et al. 2002, Rook & Bevan 2003). 애기장대에서 양적형질유전자좌(quantitative trait loci, QTL) 분석을 통해 R2R3 MYB을 암호화하는 MYB75/PAP1 전사인자가 설탕에 의해 유도되어 안토시아닌 축적을 증진시키는 후보 유전자임이 확인되었다(Teng et al. 2005). 저온처리시 배추에서 안토시아닌 생합성 조절인자인 BrMYB2, BrTT8과 구조유전자인 BrANS의 발현이 상향조절되어 안토시아닌이 축적됨이 보고되었다(Ahmed et al. 2015). 여러 작물에서 안토시아닌은 다양한 비생물적 스트레스 조건에서 식물체를 보호하는 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 안토시아닌 생성에 핵심 유전자로 밝혀진 RsMYB1의 프로모터 영역을 분리하여 세부적인 부분별로 가뭄, 염, 당, 그리고 저온 스트레스에 대한 반응을 분석하였다.

재료 및 방법

식물 재료 및 생장 조건

적색무인 신젠타 ‘Bordeaux’ 품종과 농업유전자원센터로부터 분양받은 흰색무 ‘IT160344’를 이용하여 RsMYB1 프로모터 영역을 분리하였다. RsMYB1 프로모터 형질전환은 애기장대 Columbia-0 (Col-0)에 수행하였고, 스트레스 처리를 위한 무 종자는 아시아종묘의 ‘단홍무’를 구입하여 사용하였다. 모든 식물 재료는 22℃의 장일조건(16시간 빛조건과 8시간의 암조건)에서 생육하였다.

RsMYB1 프로모터의 식물 발달 단계별 분석을 위해 Col-0와 애기장대 형질전환체들을 1/2 MS배지에 파종하여 4℃에서 암조건으로 이틀간 배양한 후 22℃ 생육상으로 옮긴 뒤 7일, 14일, 그리고 21일째 되는 식물체를 채취하여 초저온 냉장고에 보관하였다.

비생물적 스트레스 처리

비생물적 스트레스 처리를 위하여 애기장대 종자를 설탕이 포함되지 않은 1/2 MS배지에 파종하여 4℃에서 이틀간 암조건으로 배양한 뒤 22℃ 생육상으로 옮겨 7일간 생육하였다. 그 다음 설탕이 포함되지 않은 1/2 MS배지에 각각 300 mM manitol, 150 mM NaCl, 그리고 90 mM 설탕이 포함된 배지로 옮긴 뒤, 22℃에서 12시간 동안 생육시켰으며, 저온처리를 위하여 1/2 MS배지에서 생육한 식물체를 4℃에서 12시간 동안 배양하였다.

RsMYB1 프로모터 클로닝 및 애기장대 형질전환

RsMYB1 프로모터 영역은 적색무 ‘Bordeaux’로부터 genomic DNA를 추출하고, RsMYB1-GW-1 (5'-TCATCAGAGTTAAGTTTCCCTCTCTTGATACT-3')과 RsMYB1-GW-2 (5'-GGTGCCATTTCCCTTCTCCATACTTATCAATGCA-3') 프라이머와 Genome Walker Kit (Takara, Otsu, Japan)를 사용하여 분리하였다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였고, 이를 바탕으로 프라이머를 제작하여 실험을 수행하였다. Genomic DNA를 주형으로 하여 MP1-F (5'-AAACAAACAATAATGGAGGCTACTTC-3')와 RsMYB1-promoter-R (5'-GGACCAACGATAAAATATTAGAAGTA-3') 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, USA) 운반체에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 후, 크기에 따라 MP1, MP2, MP3, 그리고 MP4 영역으로 나누기 위하여 MP2-F (5'-CTTTTTATTTCACTTTCGCTTTCATTCC-3'), MP3-F (5'-CTCAACAACATGACACACTA AAATACG-3'), MP4-F (5'-TAGCTGTTGAACTGTTCCCTCTCTT-3'), 그리고 RsMYB1-promoter-R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤, pENTR/D-TOPO 운반체에 도입하였다. 그 다음 발현 운반체인 pBGWFS7 (VIB-Ghent University, Ghent, Belgium)에 클로닝하였다. 최종 운반체는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 freeze-thaw 방법을 사용하여 형질전환하였다. RsMYB1 프로모터별 아그로박테리움을 사용하여 애기장대에 floral dipping 방법(Clough & Bent 1998)으로 형질전환을 수행한 후, 22℃에서 장일조건으로 생육시켰다. 종자를 파종한 뒤 7일째에 0.3% 바스타를 처리하여 형질전환체를 선발하였다. 분석을 위하여 T3 세대까지 자가수정하여 실험재료로 이용하였다.

GUS 조직화학적 염색

프로모터의 발현부위를 확인하기 위하여 GUS 조직화학적 염색을 수행하였다. 애기장대 식물체를 GUS 염색용액(0.2 M NaPO4 (pH 7.0), 2.5 mM K3[Fe(CN)6]-3H2O (Ferri), 2.5 mM K4[Fe(CN)6]-3H2O (Ferro), 10 mM Na2EDTA (pH 8.0), 100 mg X-gluc, 25% MeOH, and 0.01% Triton-X)에 침지시킨 후, 5분간 진공처리한 뒤 37℃에서 24시간 동안 염색하였다. 70% 에탄올을 처리하여 엽록소를 제거한 후 염색부위를 현미경으로 관찰하였다.

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)

유전자 발현을 분석하기 위해 Plant Total RNA Mini kit (Favorgen, Taiwan)를 이용하여 애기장대 식물체에서 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 2 µg으로 정량한 뒤, cDNA synthesis master mix kit (GenDEPOT, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. qRT-PCR은 AccuPower 2×Greenstar qPCR Master Mix (Bioneer, Korea)와 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 수행하였다. GUS 유전자 발현분석은 GUS-qRT-F (5'-TCGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGC-3'), GUS-qRT-R (5'-CCATACCTGTTCACCACGA-3') 프라이머와 애기장대 elongation 1 alpha (AtEF1α)-F (5'-GCCACACCTCTCACATTG-3'), AtEF1α-R (5'-TACCAGCGTCACCATTCT-3') 프라이머를 이용하여 정규화하였다. 마찬가지로 RsMYB1의 발현은 RsMYB1-qRT-F (5'-GTGCATGGACTGCTGAAGAA-3'), RsMYB1-qRT-R (5'-CAGTCCGACCGGGTAATCTA-3') 프라이머와 무 식물체의 RNA polymerase-II (RsRPII)-F (5'-ATCACGCTAAATGGTCTCCT-3'), RsRPII-R (5'-GCTGCTCTCAATCAAGTCAATC-3') 프라이머를 사용하여 정규화하였다. 각 시료당 독립적인 3번의 생물학적 반복을 수행하였다.

GUS 활성 분석

100 mg의 시료에 추출 용액(50 mM NaH2PO4 (pH 7.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.1% Triton X-100, 0.1% sarcosyl, 10 mM β-mercaptoethanol)을 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 bovine serum albumin (BSA)를 이용하여 20 µg으로 정량하였다. 정량된 단백질에 1 mM의 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide hydrate (MUG)를 넣어 37℃에서 한 시간 동안 처리하였다. 한 시간 뒤 반응을 멈추기 위하여 0.2 M의 Na2CO3을 넣어준 다음 365 nm와 455 nm에서 값을 측정하였다. 정량분석을 위해 4-methyl umbelliferone (4-MU)를 이용하여 표준곡선을 작성하였고, GUS 활성을 분석하였다.

총 안토시아닌 함량 분석

총 안토시아닌 함량은 Lim et al. (2021)에 기술된 방법에 따라 수행되었다. 간략하게, 액체질소를 이용하여 시료를 분쇄한뒤 100 mg으로 정량하였다. 정량된 시료에 1% HCl이 포함된 메탄올 600 µL을 넣어준 뒤 4℃에서 교반기를 이용하여 여섯 시간 동안 잘 섞어주었다. 200 µL의 멸균수와 200 µL의 chloroform을 첨가한 뒤 원심분리하여 상층액을 분광광도계를 이용하여 530 nm (A530)와 657 nm (A657)에서 측정하였다. 총 안토시아닌 함량은 다음의 공식에 따라 계산하였다.

총 안토시아닌 함량=A530-(0.33×A657).

통계분석

실험 결과는 세 번의 독립적인 생물학적 및 기술적 반복의 평균값으로 표시되었다. 통계 프로그램은 SPSS를 사용하였으며, 통계적 유의성은 one-way ANOVA로 분석하였으며, Duncan의 다중 범위 테스트에 의해 사후분석 하였다.

결과 및 고찰

RsMYB1 프로모터의 염기서열 분석

기존 연구에 따르면 R2R3 MYB을 암호화하는 무 식물체 유래의 RsMYB1은 안토시아닌 생합성 경로 유전자들의 프로모터에 결합하여 유전자들의 발현을 활성화시켜 안토시아닌 축적을 유도하는 전사인자로 보고되었다(Lim et al. 2016). RsMYB1은 단독으로도 식물체 내에서 안토시아닌의 생성을 유도하며, bHLH 전사인자인 RsTT8과 상호작용을 통하여 안토시아닌의 생성을 강하게 증진시킨다(Lim et al. 2017).

본 연구에서는 무 식물체 유래의 안토시아닌 생합성의 핵심 유전자인 RsMYB1의 프로모터 영역을 분석하기 위하여 ‘Bordeaux’ 품종의 프로모터 영역을 genome walking을 통해 분석하였다. 염기서열 분석 후 프로모터 영역을 분리할 수 있는 프라이머를 제작하여 무 식물체 뿌리에서 안토시아닌이 축적되는 ‘Bordeaux’ 품종과 안토시아닌이 축적되지 않는 ‘IT160344’ 유전자원에서부터 각각 RsMYB1 프로모터를 분리하였다. 각각의 품종에서 분리한 프로모터의 서열 길이는 1,034 bp이며 ‘Bordeaux’와 IT160344’ 사이에서 특이적인 염기서열의 차이는 없었다. 분리된 프로모터 영역을 분석해 본 결과 가뭄, 염, 당, 그리고 저온을 포함한 비생물적 스트레스 조건에서 유도되는 다양한 cis-element가 포함되어 있음을 확인하였다(Table 1).

Table 1

Stress-related cis-elements in RsMYB1 promoter region.

Cis-element Function Conserved sequence Position from ATG Number
G-box Dehydration, high salinity, cold response CACGTG -122 1
MYBCORE Dehydration, high salinity, cold response CNCGTT(A/G) -785 1
MYC Dehydration, cold response CAA(T/C/A)TG, CAT(T/G)TG -133, -422, -679, -751 4
MYCCONSENSUSAT Cold response CANNTG -122, -133, -679, -751 4
MYB Dehydration response (A/T)AACCA -29, -88, -718, -857 4
ACGTA TERD1 Dehydration response ACGT -52, -123, -148, -276, -313, -743 6
CRT/DRE Dehydration response (A/G)(C/T)CGAC -376 1
MYBR Dehydration response TGGTTAG -28 1
W-box Salinity response TTGAC -515 1
ACGT-box Sugar response TACGTA -51 1
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A Sugar response CCTTTT -72, -244 2


RsMYB1 프로모터 영역을 네 구역으로 나누어 식물 발현 운반체를 제작하였다(Fig. 1). 프로모터의 길이가 긴 순서대로 RsMYB1 promoter 1 (MP1), MP2, MP3, 그리고 MP4로 명명하였다(Fig. 1). 비생물적 스트레스 조건에서 RsMYB1 프로모터들의 부위별 발현양상을 비교분석하기 위하여, 애기장대에 형질전환하여 T3 식물체를 확보하였다.

Fig. 1. Schematic reperesentation of RsMYB1 promoter::GUS vector construction Predicted cis-elements related to abiotic stress represent various patterns. The size of the constructs are shown in the left. BAR: bialaphos resistance gene; LB: left border; RB; right border; T35S; cauliflower mosaic virus CaMV 35S terminator.

식물 발달 단계별 RsMYB1 프로모터의 발현 양상 분석

식물 성장 시기별 RsMYB1 프로모터의 발현 양상을 확인하기 위해 1/2 MS 배지에 파종한 뒤 7일, 14일, 그리고 21일째 되는 애기장대 식물체를 이용하여 실험을 수행하였다. 식물 발달 단계별로 식물체의 성장이 진행됨에 따라 GUS 유전자의 발현이 증가되었다(Fig. 2A). 이러한 양상은 CaMV 35S (35S)로 형질전환된 개체에서도 동일하게 관찰되었다. 또한, 프로모터 부위별 발현 양상을 살펴본 결과, MP4 운반체가 다른 프로모터 운반체보다 높은 GUS 발현을 나타내었다(Fig. 2A). 발달 시기별 단백질 활성분석을 수행한 결과, 생육 초기에는 RsMYB1 프로모터별 운반체간의 유의한 차이가 관찰되지 않으나, 생육이 진행됨에 따라 앞서의 GUS 유전자 발현 양상과 유사하게 MP4 운반체에서 높은 단백질 활성을 나타냈다(Fig. 2B). 조직화학적 GUS 염색 결과, 어린시기부터 잎의 배수조직, 하배축, 그리고 뿌리에서 GUS 염색이 확인되었고, 생장함에 따라 잎과 줄기가 만나는 접합부위와 꼬투리에서도 GUS 염색이 확인되었다(Fig. 2C). 특히 성숙시기시 GUS 발현과 활성이 높은 MP3의 경우 뿌리와 잎의 접합부에서 비슷한 수준으로 GUS가 염색됨이 확인되었으나, MP4의 경우 뿌리보다는 지상부에서 GUS 염색 정도가 강한 것을 확인하였다. 따라서 MP3 영역이 뿌리에서 발현하는데 중요하리라 생각된다.

Fig. 2. Analysis of GUS expression pattern drived by RsMYB1 promoters deletion constructs in transgenic Arabidopsis plants at the various developmental stages. (A) The transcript level GUS genes at the differential growth stage. (B) GUS activities directed by the RsMYB1 promoter deletion constructs. Results represent mean values±SD from three independent biological replicates. Different letters were calculated through a one-way ANOVA analysis by Duncan’s multiple ranges and meant significantly different values (p<0.001). (C) Histochemical GUS staining of independent proRsMYB1::GUS transgenic Arabidopsis plants. WT: wild type; 35S: cauliflower mosaic virus promoter-β-glucuronidase.

식물체가 성장하는 동안 GUS 유전자의 발현이 높아짐에 따라 GUS 단백질 활성이 증가되었다(Figs. 2A, 2B). 특히, MP3MP4 운반체는 성숙시기에 높은 단백질 활성을 나타내었다(Fig. 2B). 이러한 결과를 통하여 RsMYB1은 잎의 배수조직과 하배축, 뿌리, 잎의 접합부위, 그리고 꼬투리에서 발현하는 유전자이며, 유묘기부터 성숙시기까지 발현되어 기능을 하는 것으로 생각된다. 또한 프로모터 영역별 활성을 살펴보면 MP3MP4에서 활성수준이 MP1MP2보다 높게 나타남에 따라, MP1MP2영역에 유전자의 발현을 억제하는 부위가 존재하리라 예상된다.

가뭄 조건에서의 RsMYB1 프로모터별 발현 양상 분석

식물의 성장과 발달 동안 다양한 비생물적 스트레스는 활성산소종의 생성을 유도한다. 활성산소에 의해 세포가 손상되면, 식물은 안토시아닌과 같은 항산화 물질을 생성하여 스트레스 조건하에서 스스로를 보호한다(Kovinich et al. 2015). 다양한 스트레스 조건 중에서 물부족 현상은 미래농업과 인류생존에 직면한 주요 위험요소 중의 하나이다. 따라서 적은 양의 물로도 작물의 생존 능력을 향상시키기 위한 노력이 필수적으로 요구된다. 물이 부족한 상황에서 생육된 식물에서는 안토시아닌이 축적되며 기공닫힘이 유도되어 수분손실을 억제되는 것으로 보고되었다(Cirillo et al. 2021).

가뭄조건에서 RsMYB1의 프로모터별 발현 변화를 확인하기 위해 애기장대 종자를 1/2 MS배지에서 발아시켜 7일 뒤 300 mM mannitol이 포함된 배지로 옮겨 준 후 12시간 동안 생육하였다. 그 결과 모든 운반체에서 GUS 유전자 발현이 무처리구에 비해 증가하였다(Fig. 3A). 이에 반해, 35S 프로모터의 GUS 발현은 mannitol 처리시 감소되었다. 모든 형질전환체들의 GUS 단백질 활성 역시 무처리구에 비해 mannitol 처리조건에서 증가하였다(Fig. 3B). GUS 염색을 이용한 RsMYB1 프로모터의 조직별 발현 양상은 무처리구에 비해 mannitol 처리시 GUS 염색 부위와 강도가 진해짐을 확인하였다(Fig. 3C). 이러한 결과를 통하여 가뭄조건시 RsMYB1 유전자의 발현이 증가되어 안토시아닌을 생성을 유도하고 물이 부족한 환경에서도 식물이 적응할 수 있도록 도울 것으로 여겨진다.

Fig. 3. Analysis of expression patterns in transgenic Arabidopsis plants with RsMYB1 promoter deleted construct under 300 mM mannitol treatment. (A) The transcript level GUS genes under mannitol treatment. (B) GUS activities directed by the RsMYB1 promoter deletion constructs. Results represent mean values±SD from three independent biological replicates. Different letters were calculated through a one-way ANOVA analysis by Duncan’s multiple ranges and meant significantly different values (p<0.001). (C) Histochemical GUS staining of independent proRsMYB1::GUS transgenic Arabidopsis plants. WT: wild type; 35S: cauliflower mosaic virus promoter-β-glucuronidase.

염조건에서의 RsMYB1 프로모터별 발현 양상 분석

토양의 염도는 항상성 교란 등과 같은 방식으로 식물의 성장과 발달을 제한하는 주요 문제로 간주되며, 다양한 작물의 수확량 감소를 초래한다(Golldack et al. 2014, Kisa et al. 2016). 토양내 높은 염도는 초기에 수분 스트레스를 유발하며 장기간 노출시 이온 스트레스와 같은 다른 비생물적 스트레스를 유도한다(Cramer & Nowak 1992).

염 스트레스 조건시 프로모터별 발현 양상을 비교하기 위하여, 애기장대 형질전환체에 150 mM NaCl을 처리한 결과 GUS 유전자의 발현수준이 전반적으로 증가하였다(Fig. 4A). GUS 단백질의 활성은 MP1을 제외한 모든 형질전환체에서 유의하게 증가하였다(Fig. 4B). 특히 MP3MP4에서 잎의 배수조직뿐만 아니라 잎맥에서도 GUS 염색이 확인되었으며, 이러한 결과는 RsMYB1의 발현이 염분 스트레스 조건에서 유도됨을 나타낸다(Fig. 4C). 이전 연구에 의하면, 금어초 유래 안토시아닌 생합성의 활성조절자인 Del을 과발현시킨 담배 형질전환체에 염 스트레스를 처리한 결과, 식물체에서 안토시아닌 생성이 증가하였으며, 라디칼 소거능력이 향상되어 염분에 내성이 생겼다고 보고되었다(Naing et al. 2017). 무 식물체 유래의 안토시아닌 생합성 활성조절자인 RsMYB1 유전자는 식물체가 염스트레스에 노출되었을 때 안토시아닌의 생성을 유도하여 식물체를 보호할 수 있으리라 생각된다.

Fig. 4. Analysis of expression patterns in transgenic Arabidopsis plants with RsMYB1 promoter deleted construct under 150 mM NaCl treatment. (A) The transcript level GUS genes under salt stress treatment. (B) GUS activities directed by the RsMYB1 promoter deletion constructs. Results represent mean values±SD from three independent biological replicates. Different letters were calculated through a one-way ANOVA analysis by Duncan’s multiple ranges and meant significantly different values (p<0.001). (C) Histochemical GUS staining of independent proRsMYB1::GUS transgenic Arabidopsis plants. WT: wild type; 35S: cauliflower mosaic virus promoter-β-glucuronidase.

당 스트레스 조건에서의 RsMYB1 프로모터별 발현 양상 분석

당 반응 경로는 식물 성장 및 발달과 관련된 매우 복잡한 과정이며, 광 스트레스, 질소 그리고 식물 호르몬과 같은 다양한 반응 경로와 서로 연관되어 있다(Sun et al. 2013, Ljung et al. 2015). 당은 유전자의 발현을 활성화하거나 비활성화시키는 신호분자로 작용하며, 설탕처리시 안토시아닌이 강하게 상향 조절됨이 보고되었다(Gupta & Kaur 2005). 또한 애기장대에 설탕을 처리하여 플라보노이드 생합성 경로 유전자들의 발현을 확인한 결과, 설탕의 농도가 짙어짐에 따라 유전자들의 발현이 증가하고, 안토시아닌의 함량도 유의하게 높아지는 것을 확인하였다(Solfanelli et al. 2006).

RsMYB1의 프로모터가 당에서 유도되는지 확인하기 위하여 90 mM의 설탕을 처리한 결과, 모든 형질전환체에서 GUS 유전자의 발현 수준이 증가되었다(Fig. 5A). MP3MP4의 GUS 단백질 활성은 무처리 조건과 비교하여 설탕을 처리한 실험구에서 유의하게 높아졌으며, GUS가 강하게 염색됨을 확인하였다(Figs. 5B, 5C). 당에 의해 유도되는 cis-element는 RsMYB1 프로모터 영역별로 많이 분포되어 당 스트레스 조건에서 발현에 영향하리라 판단된다(Table 1).

Fig. 5. Analysis of expression patterns in transgenic Arabidopsis plants with RsMYB1 promoter deleted construct under 90 mM sucrose treatment. (A) The transcript level GUS genes under sugar treatment. (B) GUS activities directed by the RsMYB1 promoter deletion constructs. Results represent mean values±SD from three independent biological replicates. Different letters were calculated through a one-way ANOVA analysis by Duncan’s multiple ranges and meant significantly different values (p<0.001). (C) Histochemical GUS staining of independent proRsMYB1::GUS transgenic Arabidopsis plants. WT: wild type; 35S: cauliflower mosaic virus promoter-β-glucuronidase.

저온 스트레스 조건에서의 RsMYB1 프로모터별 발현 양상 분석

생육 적온보다 낮은 온도조건인 저온은 식물 성장에 영향을 미쳐 심각한 생산성의 손실을 초래한다. 식물마다 저온(0-15℃), 및 동결(<0℃) 조건의 온도에 대해 견디는 반응이 다르다. 일반적으로 온대 기후지역의 식물은 다양한 정도의 저온내성이 있는 것으로 간주되며, 열대 및 아열대 기원의 식물들은 저온과 동결 스트레스에 민감한 것으로 보고되고 있다(Xin & Browse 2001, Sanghera et al. 2011). 무 식물체를 포함한 배추과 식물은 안토시아닌의 축적에 의해 추위 및 동결 스트레스에 대한 내성이 생긴다고 보고되었다(Ahmed et al. 2015).

저온처리시 프로모터별 발현양상을 비교하기 위해, 애기장대 형질전환체를 1/2 MS 배지에 발아시킨 뒤 7일째 되는 유식물체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였다. 모든 형질전환체들의 GUS 유전자의 발현과 GUS 단백질 활성이 무처리구에 비해 높은 수준으로 증가하였다(Figs. 6A, 6B). 조직화학적 염색 실험에서도 무처리구와 비교하여 저온처리구에서 강한 GUS 염색을 확인하였다(Fig. 6C). 이러한 결과로부터 저온처리시 RsMYB1의 발현이 증가되어 안토시아닌 생성이 유도됨을 유추할 수 있다.

Fig. 6. Analysis of expression patterns in transgenic Arabidopsis plants with RsMYB1 promoter deleted construct under cold treatment. (A) The transcript level GUS genes under cold treatment. (B) GUS activities directed by the RsMYB1 promoter deletion constructs. Results represent mean values±SD from three independent biological replicates. Different letters were calculated through a one-way ANOVA analysis by Duncan’s multiple ranges and meant significantly different values (p<0.001). (C) Histochemical GUS staining of independent proRsMYB1::GUS transgenic Arabidopsis plants. WT: wild type; 35S: cauliflower mosaic virus promoter-β-glucuronidase.

RsMYB1 프로모터 중 가장 길이가 긴 MP1은 본 실험에서 확인한 비생물적 스트레스에 의해 발현되는 정도가 다른 프로모터들에 비해 상대적으로 낮았다. 이는 MP1 영역에 유전자 발현을 억제하는 음성 cis-element가 포함되어 있을 것으로 예상된다. 또한, MP3MP4에는 유전자 발현에 필요한 많은 요소가 포함되어 있으며, 음성 cis-element를 포함하지 않아 발현수준이 가장 높은 것으로 생각된다.

비생물적 스트레스 조건에서 RsMYB1 유전자 발현 분석 및 총 안토시아닌 함량 분석

RsMYB1 프로모터 발현분석을 통해서 RsMYB1 유전자는 다양한 비생물적 스트레스에 유도되는 것을 확인하였다. 스트레스 처리하에서 RsMYB1 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 본 연구에서 분석한 네 가지의 스트레스 조건에서 무 식물체를 생육시켰다. RsMYB1 발현은 무처리 조건과 비교하여 모든 스트레스 처리 조건에서 증가하였으며, 특히 염과 저온 처리시 높은 수준으로 발현되었다(Fig. 7A). 또한, 스트레스 처리시 안토시아닌 함량은 무처리 조건에 비해 모두 증가되었으며, 유전자 발현양상과 유사하게 저온 스트레스에서 안토시아닌 함량이 의미있게 증가하였다(Fig. 7B). 이를 통해 다양한 스트레스 환경에서 RsMYB1 유전자의 발현이 활성화되고, 안토시아닌이 축적되어 식물이 다양한 스트레스에 내성을 지닐 것으로 생각된다.

Fig. 7. Expression analysis of RsMYB1 gene and total anthocyanin content in radish under various abiotic stress treatments. (A) The transcript level of RsMYB1 gene under different stress treatments. (B) Total anthocyanin content in the radish under drought, salt, sucrose, and cold treatment. Results represent mean values±SD from three independent biological replicates. Different letters were calculated through a one-way ANOVA analysis by Duncan’s multiple ranges and meant significantly different values (p<0.001).

생육기간 동안 저온에 노출되면 무 식물체의 잎과 뿌리 등에 안토시아닌이 축적된다. 본 연구 결과를 종합해 보면, 저온과 같은 스트레스 조건 하에서 안토시아닌 생성의 핵심 유전자인 RsMYB1의 발현이 높은 수준으로 증가함에 따라 안토시아닌의 생성을 유도하여 식물체를 보호하는 것으로 생각된다. 이러한 결과를 바탕으로 안토시아닌 생성을 활성화하는 전사인자인 RsMYB1이 다양한 스트레스에 의해서 발현이 유도되며 식물체가 성장과 발달과정에서 직면하는 스트레스 조건에서 적응력을 높이는데 관여하리라 생각된다. 프로모터 영역별 스트레스 처리에 대한 반응을 확인함에 따라 유전자 발현을 활성화하는 최소부위를 파악하고, 유전자 교정을 통해 이러한 부위를 변경함으로 좀 더 환경에 잘 적응하는 작물 개발에 기여할 수 있으리라 생각된다.

적 요

스트레스 조건에서 자란 식물은 과도한 활성산소종을 생성하여 세포 사멸을 초래한다. 이러한 상황에서 식물은 항산화 물질의 축적을 통해 스스로를 보호하는 메커니즘을 활성화한다. 안토시아닌은 항산화 활성이 높은 플라보노이드 유래의 2차 대사 산물이다. 본 연구에서는 안토시아닌 생합성의 양성조절자인 RsMYB1의 프로모터 영역을 분석하고 특성화하였다. RsMYB1 프로모터를 염기서열 길이에 따라 4개의 단편(MP1, -1034; MP2, -830; MP3, -633; MP4, -430 bp)으로 나눈 뒤, 각 프로모터 영역을 GUS 유전자와 융합시켜 애기장대에 형질전환하였다. RsMYB1 프로모터의 발현양상은 다양한 발달 단계와 비생물적 스트레스 조건에서 분석되었다. GUS의 발현은 식물이 생장함에 따라 증가하였고, GUS의 단백질 활성 및 조직화학적 분석은 발현 양상과 일치하였다. 또한, 가뭄, 염, 당, 그리고 저온에 조건시 MP4에서의 높은 유전자 발현과 호소 할성이 확인되었다. 이러한 분석 결과는 RsMYB1 프로모터의 proximal 영역(-430에서 -1 bp)이 염과 저온에 의해 유도되는 반응 핵심 서열임을 나타낸다. 염과 저온을 처리한 무 식물체의 RsMYB1 발현 수준은 고도로 활성화 되었으며, 안토시아닌 함량 역시 증가되었다. 이러한 결과는 RsMYB1 유전자의 발현 유도는 스트레스 조건에서 식물이 적응하는데 도움을 주는 안토시아닌의 생성을 활성화할 것으로 예상된다.

사 사

본 논문은 농촌진흥청 국립농업과학원의 공동연구과제(PJ014554)와 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단(NRF-2020R1F1A1072559)의 지원을 받아 수행된 연구임.

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December 2021, 53 (4)
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