녹두(Vigna radiata L.)는 콩과에 속하는 한해살이 작물로 원산지는 인도와 미얀마 지역이다(Kim et al. 2013). 녹두는 단백질 함량이 높으며(20~24%) 칼로리는 낮고, 다른 두과 작물에 비해 높은 탄수화물(50~60%)과 기능성 물질을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다(Peng et al. 2008, Tang et al. 2014). 녹두 에탄올 추출물에서는 항산화와 항염증에 효과적인 vitexin과 isovitexin이 다량 함유되어 있는 것으로 보고된 바 있다(An et al. 2020). 최근 미국에서는 JUST Egg라는 상품명으로 녹두를 활용한 계란 대체 상품이 개발되었으며(www.ju.st), 대부분의 아시아 국가에서는 녹두를 녹말과 숙주나물의 형태로 소비하고 있다. 숙주나물은 재배기간이 짧으며 연중 생산이 가능하여 식품으로써 활용이 용이하고, 숙주나물로 재배 시 녹두 종자에 비해 많은 양의 phenolic compounds와 flavonoids를 함유하는 것으로 보고되었다(Kim et al. 2014).

숙주나물은 주로 콩나물과 비교되며 생김새와 재배방법에 있어서도 유사한 점을 보인다. 콩나물의 경우 적합한 재배방법, 품종 간 기능성 물질 함량 비교와 조직 별 기능성 물질 비교 등 다양한 연구가 진행되어 왔다. 콩나물에서의 조직 별 연구 결과 isoflavonoid의 함량은 뿌리, 자엽, 하배축의 순으로 나타났으며, 조직 별로 높게 측정되는 물질이 다른 것을 확인할 수 있었다(Kim et al. 2000a, Kim et al. 2000b, Kim et al. 2006). 숙주나물에서도 재배조건 및 환경변화에 따른 기능성 물질 변화 등 콩나물과 유사한 실험이 많이 진행되어 왔으나 조직 별 기능성 물질 비교에 대한 연구는 부족한 실정이다(An et al. 2020, Kang et al. 2004). 따라서 숙주나물의 조직 별 기능성 물질 함량 비교 분석은 숙주나물의 건강 증진식품으로의 활용과 품종 개량 등 다양한 측면에서 유용한 자료를 제공할 수 있을 것이다.

녹두는 국내에서 다양한 품종(금성, 경선, 장안, 어울, 선화, 다현, 삼강 등)이 재배되고 있다(Kim et al. 2007, Kim et al. 2010). 본 연구는 세 품종의 녹두(선화, 다현, 삼강)를 활용하여 숙주나물의 조직 별 생장과 생리활성을 측정하였다. 선화는 녹두의 표준 유전체로 활용되는 대표적인 품종으로 종자의 크기가 크며 주로 녹말 생산에 이용된다(Kim et al. 2007, Kim et al. 2015). 삼강은 국내에서 숙주나물로 활용되는 품종 중 하나로 표준 품종인 선화에 비해 숙주나물 재배 시 수율이 높은 것으로 알려져 있다(Lee et al. 2004). 다현은 숙주나물의 생리활성 연구에 많이 이용되어진 품종이며, 다른 품종보다 숙주나물로 활용 시, flavonoids와 DPPH radical 소거능이 비교적 높은 것으로 보고된 바 있다(Kim et al. 2009, Jin et al. 2010). 숙주나물로 이용되는 품종은 재배 수율을 기준으로 정해지고 있으며, 표준 품종과의 기능성 물질 함량 비교 연구는 이루어지지 않았다. 따라서 녹두의 표준 품종인 선화, 숙주나물로 이용되고 있는 삼강, 그리고 다른 품종에 비해 기능성 물질의 함량이 높은 것으로 알려진 다현을 활용하여 숙주나물의 품종 및 조직 별 기능성 물질의 함량과 항산화능의 차이에 대한 정보를 제공하고자 연구를 진행하였다.

식물 재료 및 형태적 특성 측정

세 품종의 녹두(선화, 다현, 삼강)은 강릉원주대학교 온실에서 재배 및 수확한 종자를 사용하였다. 각 품종 별 100립씩 파종하였으며, 증류수로 종자를 3회 세척하여 배양기(JEIO TECH, ISS- 4075R)를 통해 37℃에서 17시간동안 침지처리 후 재배에 사용하였다. 이전에 진행한 연구 결과에 따라 4시간마다 2분간 물을 분사하는 방식으로 새싹재배기(Sundotcom, ST001A)를 통해 숙주나물을 재배하였으며 재배온도는 28±2℃로 설정하였다(Kim et al. 2021). 재배기간이 증가함에 따라 건물중이 감소하는 것을 고려하여 재배 1, 2, 3일차에 각 25개체, 25개체, 50개체를 샘플링 하였고, 재배된 숙주나물의 조직 별 길이는 ImageJ를 통해 사진상의 자에서 직선 길이 측정 기능인 straight line으로 기준 길이를 설정한 후 자유선 길이 측정 기능인 freehand line을 활용하여 각 조직 별 길이를 측정하였다(Schneider et al. 2012). 자엽의 길이는 하배축과 자엽의 경계에서 자엽의 끝까지의 길이를 측정하였으며, 하배축의 길이는 자엽부터 하배축의 두께가 얇아지기 시작하는 부분까지의 길이로 측정하였다. 뿌리의 길이는 하배축의 측정이 끝나는 부분부터 뿌리의 끝까지의 길이로 측정하였으며, 하배축의 두께는 가장 두꺼운 부분에서 straight line으로 측정하였다. 측정이 완료된 숙주나물은 품종, 재배일 및 조직 별로 분리하여 배양기(JEIO TECH, ISS-4075R)에서 70℃로 24시간 건조한 후 마쇄하여 보관하였으며, 70% EtOH (Supelco, Cat. No. 1009831011)로 10 mg/mL (w/v)로 추출하여 실험에 사용되었다. Total phenol, total flavonoid, DPPH radical 소거능은 추출물의 농도를 5 mg/mL로 조정하여 사용하였으며, ABTS radical 소거능은 추출물의 농도를 1 mg/mL로 조정하여 사용하였다.

Total phenol 측정

Total phenol의 함량은 Lee & Lee (2008)의 방법을 일부 수정하여 측정하였으며(Lee & Lee 2008), 표준물질로 Gallic acid (Sigma-Aldrich^®, G7384) (0, 50, 100, 200 mg/L)를 사용하였다. 각 추출물과 Gallic acid 용액 100 μL에 Folin-Ciocalteu 용액(Sigma-Aldrich^®, Cat. No. 47641)을 50 μL씩 가한 후 5분간 방치한다. 그 다음 20% Na₂CO₃ (FUJIFILM, 199-01605) 용액을 300 μL씩 첨가한 후 암조건에서 15분간 반응시킨다. 반응이 끝난 용액에 증류수를 1000 μL 가한 후 원심분리기(GYROZEN, 1730R)에서 2분간 원심분리를 진행한다. 원심분리가 완료된 용액은 96 well plate에 200 μL씩 3반복으로 넣고 분광광도계(Thermo Scientific, MIB, Multiskan FC)를 이용하여 740 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

Total flavonoid 측정

Total flavonoid의 함량은 Matejić et al. (2013)의 방법을 일부 수정하여 측정하였으며, 표준물질로는 Quercetin (Sigma-Aldrich^®, Q4951) (0, 50, 100, 200 mg/L)을 사용하였다(Matejić et al. 2013). 1 M Potassium acetate (FUJIFILM, 169-21965)와 10% Aluminium nitrate nonahydrate (JUNSEI, 37350-1201)를 1:1 (v/v)로 섞은 용액을 농도 별 Quercetin 용액과 추출물 500 μL에 각 200 μL씩 가한 후 40분간 암조건에서 반응시킨다. 반응이 완료된 용액은 96 well plate에 150 μL씩 3반복으로 넣고 분광광도계를 이용하여 420 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH radical 소거능 측정

DPPH radical 소거능은 OxiTec™ DPPH Antioxidant Assay Kit (BIOMAX, BO-DPH-500)를 사용하여 키트 매뉴얼에 따라 측정하였다. 표준물질로는 Trolox (0, 40, 60, 80, 100 mg/L)를 사용하였으며, 각 추출물과 Trolox를 20 μL씩 3반복으로 96 well plate에 넣었다. Blank 1과 2 well에는 70% EtOH를 20 μL씩 넣고, Blank 3 well에는 100% EtOH를 20 μL 넣는다. 각 시료와 Trolox가 든 well과 Blank 1에 Assay Buffer 80 μL를 가하고 Blank 2와 3에는 100% EtOH를 100 μL씩 가한다. 시료와 Trolox, Blank 1 well에 DPPH 용액 100 μL를 가한 후 암조건에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 plate는 분광광도계를 이용하여 520 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS radical 소거능 측정

ABTS radical 소거능은 Kusumah et al. (2020)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다(Kusumah et al. 2020). 7.4 mM ABTS (Roche, Cat. No. 10102946001)용액과 2.6 mM potassium persulfate (YAKURI, Cat. No. 28718)를 1:1 (v/v)로 희석하여 암조건의 실온에서 24시간 동안 반응시킨다. ABTS와 potassium persulfate 혼합 용액을 10 mM의 PBS buffer (Gibco, Cat. No. 10010023)로 740 nm파장에서 흡광도가 0.7±0.03가 되도록 희석한다. 표준물질로는 Ascorbic acid (FUJIFILM, Cat. No. 012-04802) (0, 1, 5, 10, 20, 40 mg/L) 를 사용하였다. 각 추출물과 Ascorbic acid를 96 well plate에 20 μL씩 3반복으로 넣은 후 ABTS 혼합 용액을 180 μL씩 첨가하여 암조건에서 10분간 반응시켰다. 반응이 완료된 plate는 분광광도계를 이용하여 740 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

숙주나물의 형태적 특성(자엽, 하배축, 뿌리의 길이, 하배축의 두께)은 재배한 식물체 중 품종별로 20개체를 무작위로 선정하여 측정하였다. 모든 통계자료는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 통해 유의수준 0.05에서 유의성을 검사하였으며, RStudio를 통해 Duncan’s Multiple Range test로 사후검정을 진행하였다(Stahle & Wold 1989, RStudio Team 2021).

형태적 특성 측정 결과

본 실험에서 사용된 숙주나물은 4시간마다 2분간 관수하는 조건으로 재배했을 경우, 발아 후 4일부터 상배축이 발생한다는 결과에 따라 숙주나물로써 활용에 가장 적합하다고 판단되는 3일차에 샘플링을 진행하였다(Kim et al. 2021). 숙주나물의 자엽과 하배축의 길이는 재배일에 상관없이 선화 품종이 통계적으로 유의미하게 다른 두 품종에 비해 높은 수준을 보였다(Figs. 1a, 1b). 자엽의 경우 재배일 경과에 따른 큰 변화는 나타나지 않았으며, 하배축의 길이는 지속적으로 증가했다(Figs. 2a, 2b). 뿌리의 길이 또한 지속적으로 증가하였으며 재배 2일차까지 선화가 가장 높은 수치를 보였으나, 3일차 숙주나물에서는 품종 간 유의적인 차이를 확인할 수 없었다(Figs. 1c, 2c). 하배축의 두께는 모든 품종에서 재배 2일차까지 증가했으며, 3일차부터 두께의 변화는 나타나지 않았고, 재배 2일차부터 품종 간의 유의적인 차이가 확인되지 않았다(Figs. 1d, 2d). 콩나물의 경우 하배축이 긴 것 보다 자엽이 작고 하배축이 두꺼운 것이 소비자들에게 높은 선호도를 보인 것으로 알려져 있으며, 이러한 특징은 활용 방법과 생김새가 유사한 숙주나물에서도 같은 경향으로 나타날 것으로 생각된다(Park et al. 1995).

Fig. 1. Measurement of physical trait of mungbean sprouts. (a) Cotyledon length, (b) Hypocotyl length, (c) Root length, (d) Thickness of hypocotyl. Cultivars are indicated by colors. Statistical analysis was conducted by One-way analysis of variance (ANOVA) and post- hoc Duncan test (p<0.05).

Fig. 2. Measurement of physical trait of mungbean sprouts according to cultivation period for cultivars. (a) Cotyledon length, (b) Hypocotyl length, (c) Root length, (d) Thickness of hypocotyl. Cultivation period are indicated by colors. Statistical analysis was conducted by One- way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc Duncan test (p< 0.05).

날짜 별 생리활성 측정 결과

모든 품종에서 재배일이 경과할수록 생리활성(phenol, flavonoid, DPPH and ABTS)이 증가하는 것으로 나타났으며, 재배기간 동안의 total phenol 함량은 선화가 가장 높았다(Fig. 3a). Total flavonoid 함량의 경우 재배 1일과 2일차에서 선화가 가장 높았으나, 3일차에서는 다현 0.05±0.004 mg/g, 삼강 0.04±0.004 mg/g, 선화 0.05±0.004 mg/g으로 세 품종간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Fig. 3b). DPPH radical 소거능은 재배일이 경과할수록 점차 증가했으며, 1일차 숙주나물에서는 다현이 15.1±1.9%로 가장 높은 수준을 보였으나 3일차에서는 다현이 26.7±1.6%로 가장 낮았으며, 선화가 2일차와 3일차에서 각각 22.1±1%와 31.6±0.5%로 높은 항산화능을 보였다(Fig. 3c). ABTS radical 소거능의 경우 재배일과 상관없이 선화가 유의적으로 높은 수준을 보였으며, 다현과 삼강은 모든 재배일에서 같은 수준으로 나타났다(Fig. 3d). 이러한 실험 결과를 통해, 숙주 나물로 재배 시, 선화보다 수율이 우수하며 다른 품종에 비해 기능성 물질 함량이 높다고 알려진 다현이 형태적 특성에서는 선화보다 우수하지만, 생리활성적 측면에서 선화에 비해 낮은 수준임을 확인할 수 있었다(Fig. 3) (Lee et al. 2004, Kim et al. 2009, Jin et al. 2010). 따라서 숙주나물의 효율적인 소비를 위해서는 생산수율과 형태적 특성뿐만 아니라 항산화 물질 함량까지 우수한 품종의 선별 기준이 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 3. Measurement of biochemical characteristics of mungbean sprouts. (a) Total phenol content, (b) Total flavonoid content, (c) DPPH inhibition rate, (d) ABTS inhibition rate. Cultivars are indicated by colors. Measurement of functional substances by tissues are carried out under day three. Statistical analysis was conducted by One-way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc Duncan test (p<0.05).

조직 별 생리활성 측정 결과

숙주나물의 조직별 total phenol 함량의 경우, 자엽은 다현 4.3±0.04 mg/g, 선화 4.4±0.06 mg/g으로 같은 수준을 보였으며, 삼강 3.9±0.03 mg/g에 비해 높은 수준으로 나타났다. 하배축은 다현 12.8±0.12 mg/g, 삼강 12.9±0.12 mg/g으로 선화에 비해 높았다. 뿌리의 phenol 물질 함량의 경우 삼강이 7.5±0.04 mg/g으로 가장 높았으며, 종피의 경우 선화가 0.3±0.01 mg/g으로 가장 높았다(Fig. 3a). 조직 별 total flavonoid 함량의 경우, 자엽에서 다현이 0.04±0.004 mg/g으로 가장 높았고, 종피에서는 선화가 0.04±0.001 mg/g으로 가장 높은 수준으로 측정되었다. 하배축과 뿌리의 flavonoid 물질 함량의 경우, 세 품종 간 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, 하배축의 flavonoid 함량은 선화가 0.08±0.008 mg/g으로 가장 높은 수치를 보였다(Fig. 3b). DPPH radical 소거능의 경우 하배축에서는 삼강이 53.8±1.1%로 가장 높은 항산화능을 보였으며, 다른 조직에서는 품종 간 차이가 나타나지 않았다(Fig. 3c). ABTS radical 소거능의 경우, 자엽에서 다현이 39.1±1.8%, 선화가 41.6±1.5%로 삼강에 비해 높은 수준으로 나타났으며, 다른 조직에서는 품종 간 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 3d).

품종 내에서 숙주나물의 조직 별 생리활성 비교 결과, 품종과 상관없이 모든 실험에서 하배축이 유의적으로 가장 높은 수치로 나타났으며, total phenol 함량은 모든 품종에서 하배축, 뿌리, 자엽, 종피 순으로 나타났다(Fig. 4a). Total flavonoid 측정 결과 다현 품종은 하배축을 제외한 자엽, 뿌리 그리고 종피에서 비슷한 수준의 함량을 보였으며, 삼강 품종에서는 하배축, 뿌리, 자엽, 종피의 순으로 phenol 물질 함량과 유사한 경향을 보였다. 선화 품종의 flavonoid 물질 함량의 경우, 하배축 다음으로 뿌리와 종피에서 같은 수준의 함량을 보였으며, 자엽이 0.03±0.002 mg/g으로 가장 낮은 수준을 보였다(Fig. 4b). 항산화능 측정 결과 DPPH radical 소거능은 phenol 물질 함량과 유사한 경향성을 보였으나, 다현과 삼강 품종의 경우, 자엽과 종피 간의 유의한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 4c). ABTS radical 소거능의 경우, 다현과 삼강 품종에서 자엽과 뿌리의 활성이 비슷한 수준으로 나타났으며, 선화 품종에서는 자엽이 42±1%로 뿌리 33±1%에 비해 높은 활성을 보였고, 세 품종 모두 종피에서 가장 낮은 활성이 나타났다(Fig. 4d). Shi et al. (2016)의 연구에 따르면 녹두는 품종 간 기능성 물질의 함량에 확실한 차이가 있었으며, 숙주나물과 가장 유사하다고 할 수 있는 콩나물에서 진행된 연구에서는 품종과 조직에 따라 기능성 물질의 함량에 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다(Kim et al. 2006, Shi et al. 2016). 숙주나물 또한 품종과 조직에 따라 함유하고 있는 기능성 물질에 차이가 있으며, 이러한 이유 때문에 품종에 따라 다양한 경향성이 나타난 것으로 생각된다. 추후 숙주나물의 조직 별 정성분석과 생합성 경로 연관 유전자 탐색을 진행한다면 나물용 녹두 품종 개발에 있어 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

Fig. 4. Measurement of biochemical characteristics by tissues of mungbean sprouts. (a) Total phenol content, (b) Total flavonoid content, (c) DPPH inhibition rate, (d) ABTS inhibition rate. Tissues are indicated by colors. Statistical analysis was conducted by One- way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc Duncan test (p< 0.05).

녹두는 탄수화물과 단백질의 함량이 높은 두과 작물로 최근 많은 연구가 진행되고 있다. 다른 두과 작물에 비해 녹두는 비교적 높은 기능성 물질 함량을 보였으며, 항산화와 항염증 기능이 있는 vitexin과 isovitexin을 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 아시아 지역에서는 녹두를 주로 숙주나물과 녹말의 형태로 소비하고 있으며, 숙주나물로 소비 시 종자에 비해 많은 기능성 물질을 섭취할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 숙주나물로 주로 이용되는 다현, 삼강과 녹말로 주로 이용되고 있는 선화 품종을 활용하여 숙주나물의 조직 별 형태적 특성과 기능성 물질 함량을 비교하였다. 세 품종의 숙주나물 재배는 같은 조건에서 3일동안 진행되었으며, 3일차 숙주나물에서 4부위(자엽, 하배축, 뿌리, 종피)로 나누어 실험을 진행하였다. 형태적 특성 측정 결과, 재배 3일차까지 선화가 다른 품종들에 비해 높은 수준을 보였으나, 소비자의 선호도를 고려했을 때 하배축의 길이는 짧지만 두께는 비슷하고 자엽의 크기가 작은 다현과 삼강 품종이 숙주나물로 활용하기 더욱 적합한 것으로 나타났다. 숙주나물의 기능성 물질과 항산화능 측정 결과, 숙주나물로 선호되지 않는 선화가 다른 품종에 비해 우수하게 나타났다. 조직 별 기능성 물질 측정 결과 phenol 물질의 함량은 모든 품종에서 하배축, 뿌리, 자엽, 종피의 순서로 같은 경향성을 보였으며, flavonoid 물질 함량의 경우 세품종 모두 상이한 경향성을 보였다. 항산화능의 경우 DPPH radical 소거능은 phenol 물질 함량과 유사한 경향성을 보였으며, ABTS radical 소거능은 세품종 모두 상이한 경향성을 보였다. 이러한 결과를 통해 숙주나물의 품종에 따라 함유하고 있는 기능성 물질에는 확실한 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과, 숙주나물은 품종에 따라 형태적 특성과 생리활성에서 유의미한 차이를 보였다. 하지만 숙주나물로 이용되고 있는 삼강과 다현의 경우, 형태적 특성은 우수하였으나, 선화에 비해 기능성 물질 함량과 항산화능에서 부족한 모습을 보였다. 기능성 물질 함량 측정 결과, 숙주나물의 품종과 조직 별로 확실한 차이를 보였으며, ABTS radical 소거능 측정 결과 품종 별로 상이한 경향성을 보였다. 현재 사회의 생활수준과 건강에 대한 관심이 높아지면서 숙주나물의 소비량은 점차 증가하고 있다. 하지만 숙주나물용 품종은 재배 수율을 기준으로 정해지고 있으며, 숙주나물용 품종 중 기능성 물질의 함량이 비교적 높은 것으로 보고된 다현이 녹말 생산에 이용되는 표준품종인 선화 보다 항산화 능력이 낮은 것으로 확인되었다. 이러한 점에 있어서 숙주나물의 효율적인 소비를 위해서는 재배 수율 뿐만 아니라 기능성 물질 함량까지 고려해볼 필요가 있을 것으로 생각된다. 또한 각 품종 및 조직 별 정성분석과 생합성 경로 연관 유전자에 대한 연구를 진행하게 된다면 숙주나물용 품종 개량에 있어 더 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2021R1C1C1004233).