상업용 옥수수 품종 개발에는 반수체 유기체와 배가반수체(doubled haploid, DH) 기술을 널리 이용한다(Prigge & Melchinger 2012, Kim et al. 2014, Chaikam et al. 2019, Wu et al. 2020). 반수체 유기체란 정상적인 2배체 옥수수와 교배하였을 때 얻은 이삭의 종자들이 2배체(2n)와 일부는 비정상적인 수정으로 인하여 반수체(n)로 분리되는 특별한 유전 계통들을 말한다(Prasanna 2012). 반수체 배를 갖는 종자는 정상적인 3배체(3n)의 배유를 갖고 있어 2배체 배를 갖는 알곡과 마찬가지로 발아할 수 있다고 알려져 있다(Coe & Sarkar 1964).

Coe (1959)는 Stock6라고 하는 반수체 유기계통(반수체 유기율 2.3%)을 처음 보고하였는데, 이후 여러 연구자에 의해 종자 상태 또는 유묘에서 반수체를 쉽게 확인할 수 있도록 안토시아닌 색소 표지를 유기체에 도입하였고(Nanda & Chase 1966, Greenblatt & Bock 1967, Irwin & Margaret 1967, Chase 1969, Altuntaş et al. 2019, Baleroni et al. 2021, Wang et al. 2021), 새로운 육종계통을 육성하는데 필요한 시간, 노동, 비용 등을 절감함으로써 품종 육성이 가속화되었다(Geiger & Gordillo 2009, Maqbool et al. 2020, Meng et al. 2021).

현재 in vivo 모계 반수체 유기체계는 R1-Navajo (R1-nj)라고 하는 안토시아닌 색소 표지의 존재 여부에 따라 배에는 안토시아닌 색소가 없고 배유에는 왕관 형태의 색소가 발현되는 반수체(haploid, n) 종자와 배와 배유 모두에서 안토시아닌 색소 침착되어 2배체 종자를 육안으로 구분이 가능한 배수체(diploid, 2n)가 있으며, 이러한 표현형을 Navajo 종자표현형이라고 한다(Nanda & Chase 1966, Greenblatt & Bock 1967, Chase 1969, Lee et al. 2020).

상업적인 규모로 DH 기술을 적용하는 데에는 종자 단계에서 반수체를 확인하는 것이 매우 중요하다(Melchinger et al. 2013, Qu et al. 2021). 비록 C1-l과 같은 안토시아닌 억제 유전자 존재 여부에 따라 사용에 제한받기는 하지만(Edwards et al. 2001), 옥수수 자원 내 C1-l 유전자 빈도가 약 8% 정도인 것을 감안한다면(Prasanna 2012), Navajo 종자표현형 매우 효과적인 검정법이라고 할 수 있다.

Navajo 종자표현형으로 반수체 확인의 정확성과 속도는 배와 배유의 색소발현을 통한 반수체 확인에 대해 잘 알고 있는 훈련된 사람에 의해 좌우되는데, 보다 간편하게 대량의 반수체를 분석하고자 분광 영상을 이용한 시도가 있었다(Collings 2019, Mackon et al. 2021, Cristiane et al. 2022). 또한 수확시기의 종자 수분함량은 색소발현의 강도에 영향을 줄 수 있어(Rotarenco et al. 2010), Navajo 종자표현형 검정법의 정확성을 떨어뜨리는 원인이 된다.

본 연구에서는 사람의 육안으로 옥수수 종자의 반수체를 선발해왔던 방법을 형광 영상으로 안토시아닌 색소 표지의 발현 여부를 분석하여 기존 선발 방법의 작업 속도와 정확성 등 효율성을 개선하기 위해 수행되었다.

옥수수종자 유전자원재료

강원도농업기술원 옥수수연구소에서 HW9/HW1, HW9/14S8015, 15S6339/15S6066, Gangwon35/NK6240, P1543/Sirus 등의 집단과 반수체 유기체의 교배를 통해 얻은 2배체(2n) 종자각각 100립과 반수체(n) 종자 각각 50립씩 분양받아 형광영상(FI: Fluorescence image)을 활용하여 종자 특성을 조사하였다.

영상 측정 장치

안토시아닌은 식물에 축적되는 형광성 색소 중 하나로 알려져 있다. 이를 이용해 형광 카메라를 이용해 많은 연구가 진행되었다(Chanoca et al. 2018, Choi et al. 2021, Mackon et al. 2021, Ren et al. 2021, Zhang et al. 2022)

본 연구에 사용된 형광카메라는 PSI에서 제작된 1280 x 1024 해상도와 400~1,000 nm의 파장대역을 탐지하는 CCD 카메라로서 2000 umol의 출력의 Action 라이트와 4000 umol의 출력을 가지는 수퍼 펄스 조명, 그리고 각 455에서 735 nm까지 파장대의 광원을 활용하여 종자 영상을 촬영하였다(Fig. 1). 각각 촬영된 종자 영상은 Fluorcam 7 프로그램(NOWICKA. 2019)을 이용하여 분석하였다.

Fig. 1. Fluorescence imaging device.

종자 영상 촬영

옥수수 종자의 안토시아닌 색소표지 발현된 특징을 탐지하기 위해 형광 영상으로 촬영하였다(Figs. 2A, 2B). 반수체와 배수체의 선별 작업 시간 절약을 위해 A4크기의 배경판 위에 10립씩 5줄로 50립의 종자를 펼쳐 놓고 광원을 투사하여 형광 영상을 촬영하였다(Fig. 3). 이러한 방법은 분광 영상을 활용하여 매우 빠르고 대량으로 촬영할 수 있는 High throughput 방법으로 촬영에 걸리는 시간은 1회당 5초 정도로 총 750립의 종자를 촬영 준비시간과 50립씩 15회 촬영으로 5분 정도에 종자 선별을 할 수 있었다.

Fig. 2. Detection of anthocyanin color markers in maize seeds. (A) RGB image. (B) Fluorescence image.

Fig. 3. Fluorescence imaging using high-throughput method by Fluorcam 7 software.

배수체와 반수체 종자 검정

종자의 배수체와 반수체를 빠르고 쉽게 검정하는데 가장 효과적인 방법은 종자를 절단하여 배 부분에 보라색 안토시아닌 성분이 있는지 확인하는 것이다. 반수체 종자는 배 부분에 색상이 존재하지 않고 반수체에만 색상이 존재한다(Fig. 4). 하지만 이는 종자를 파괴하는 방법으로 육종에 활용할 수 없어 효과적인 방법이 될 수 없다. 하지만 본 논문에서는 형광장치를 통해 선발한 방법이 사람의 육안으로 선발한 것과 비교하여 정확도가 얼마나 나오는지를 확인하기 위해 종자를 절단하는 파괴적인 방법을 이용하여 검정하였다.

Fig. 4. Classification of diploid and haploid by the expression of color markers.

색소표지 탐지 범위

R1-nj 유전자의 발현으로 나타나는 안토시아닌 성분의 자색 색소표지는 배수체 특성을 가지는 옥수수의 배(embryo)에 존재한다. Figs. 5A, 5B는 기존 육안으로 분석할 때 안토시아닌 색소표지 영역을 표시하였다. 해당 영역에 색소표지가 눈으로 관찰되는 유무에 따라 반수체와 배수체로 선별하였다. Figs. 5C, 5D는 형광영상을 활용한 분석 방법이다. 영상에 색소표지 영역으로 분리가 될 때 반수체와 배수체로 선별하는 방법이다. 하지만 색소표지가 적은 양으로 발현될 때 종자 속에 존재하게 되어 겉으로 잘 드러나지 않아 문제가 되고 있으며 이를 해결하기 위해 본 논문에서는 형광장치가 옥수수 종자의 앞면과 뒷면 모든 부분에서 색소표지를 탐지 할 수 있는지에 대한 투과 실험을 Figs. 6, 7과 같이 진행하였다. 또한 Fig. 5와 같이 종자의 배 부분의 영역에서 나타나는 색소표지의 특징을 촬영된 영상의 관심영역(RoI: Region of Interest)을 설정하여 탐지의 정확도를 높였다.

Fig. 5. Confirmation of anthocyanin color marker area by RoI setting. (A) RoI of total area in RGB image. (B) RoI of target area in RGB image. (C) RoI of Total area in florescence image. (D) Roi of target area in florescence image.

Fig. 6. Fluorescence expression of maize diploid seeds arranged on the front side. (A) RGB image (B) Fluorescence expression image.

Fig. 7. Not Fluorescence expression of maize diploid seeds arranged on the back side (four seeds). (A) RGB image with 4 seeds flipped by random selection. (B) Fluorescence undetected image of 4 seeds.

Gangwon35/NK6240 집단과 반수체 유기체를 교배하여 얻은 배수체(2n) 종자 20립을 앞면과 뒷면을 배치하여 각각 형광장치로 촬영하였다.

앞면으로 배치된 옥수수 배수체 종자에서는 20립 모두 R1-nj 유전자에 의한 색소표지가 형광장치를 통해 탐지되어 잘 작동하는 것을 확인하였다(Figs. 6A, 6B).

반면 배수체로 탐지된 종자 20립 중 붉은색으로 표시한 종자 4립을 랜덤 선발하여 뒷면으로 재배치하고 촬영 한 결과 종자 속 가운데에 색소표지의 탐지가 안 되는 현상이 발견되었다(Figs. 7A, 7B). 이는 색소표지가 종자 속에 존재하여 광선이 충분히 투과되지 않아 색소표지 탐지를 못한 것으로 판단된다. 이러한 결과로 인해 본 논문에서는 형광장치를 이용하여 배수체와 반수체를 판별하는 실험은 앞면으로 종자를 배치하여 진행하였다.

형광장치를 이용한 색소표지 탐지

강원도 옥수수연구소에서 분양받은 HW9/HW1, HW9/14S8015, 15S6339/15S6066, Gangwon35/NK6240, P1543/Sirus 등의 집단과 반수체 유기체의 교배를 통해 얻은 배수체 종자 100립과 반수체 종자 50립을 앞면으로 배치하여 색소표지 탐지를 위한 형광 분석을 진행하였다(Fig. 8).

Fig. 8. Analyzing the accuracy of the screening of haploid and diploid using fluorescence images. Visually selected haploid and diploid seeds were tested for accuracy using fluorescence images.

Fig. 8의 결과로 HW9/HW1, HW9/14S8015, 15S6339/15S6066, Gangwon35/NK6240, P1543/Sirus 집단에서 먼저 반수체 유기체와 교배하여 얻은 종자를 사람이 육안으로 반수체라고 판단하고 선별하였다. 반수체 검정을 위해 육안으로 선별된 50립을 형광장치로 분석한 결과 배수체로 판단되는 종자를 각각 6개, 10개, 21개, 16개, 15개를 탐지할 수 있었고 형광분석 결과물의 검정을 위해 종자를 절단하여 색소표지를 확인한 결과 각각 1개, 6개, 7개, 6개, 6개가 반수체로 확인되었다. 다음으로 사람이 육안으로 배수체라고 판단하여 선발한 100립은 50립씩 나누어 2회에 걸쳐 형광영상으로 촬영하여 분석하였다. 촬영된 형광영상에서 R1-nj와 관련된 안토시아닌 색상표지가 확인되어 각각 4개, 4개, 4개, 3개, 1개를 탐지 할 수 있었다. 형광영상으로 탐색된 종자의 검정을 위해 절단하여 색소표지를 확인한 결과 1개, 3개, 1개, 3개, 1개가 배수체로 판별되었다. 이는 형광영상으로 추가적인 반수체와 배수체 종자를 선별함으로서 육안으로 판별한 750립 종자에 대하여 선별 정확도를 높일 수 있음을 보여준다.

형광영상을 이용한 효율성 비교

형광분석한 결과를 토대로 사람과 형광장치를 이용하여 반수체와 배수체를 선발하는 정확성을 비교하여 육안선발(Fig. 9A)과 형광선발(Fig. 9B)에 대한 확인을 수행하였다. 그 결과 HW9 계통에서 육안으로 반수체로 선발되었으나 형광에서는 배수체로 선발되어 False-positive가 발생하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 9B). 사람이 선발한 종자를 기준으로 형광장치로 촬영하여 반수체 및 배수체 종자를 확인하였고 목적에 맞게 탐지된 종자는 절단하여 색소표지를 확인함으로 재점검하여 형광장치를 이용한 선발 정확도를 보정하였다(Table 1). HW9/HW1, HW9/14S8015, 15S6339/15S6066, Gangwon35/NK6240, P1543/Sirus의 순서로 사람은 반수체 50개 배수체 100개를 선발하였지만 형광장치는 각각 44개, 40개, 29개, 34개, 35개를 선발하여 사람보다 형광장치를 이용하여 선발하는 효율이 12%, 20%, 42%, 32%, 30%로 더 좋았으며, 종자 절단 확인결과 옥수수 종자의 불균형적인 형태와 종자 중심에 위치한 색소표지의 미탐지등이 원인으로 판단되는 선발의 false-positive는 1개, 6개, 7개, 6개, 6개로 확인되었다. 이를 반영하여 형광영상을 활용한 최종 반수체 선발의 정확성이 10%, 8%, 28%, 20%, 18% 정도가 향상하는 것을 확인하였다. 배수체의 경우 형광장치를 활용하여 96개, 96개, 96개, 97개, 99개를 선발하여 4%, 4%, 4%, 3%, 1%로 더 좋았으며, 종자 절단 확인결과 형광장치의 선발 오류 1개, 3개, 1개, 0개, 0개를 반영하여 최종 배수체 선발의 정확성이 각각 3%, 1%, 3%, 3%, 1%의 선발의 정확성이 향상하는 것을 확인하였다(Fig. 10). 이러한 영상 분석 결과를 검증하기 위해 계통별, 배수성, 측정 방법 등 세 종속 변인들의 영향을 일원분산분석(one-way ANOVA, one-way analysis of variance)을 이용하여 평가하였다(Girden 1992) (Table 2). 각 변인들에 따라 결과에 대한 차이가 없음을 null hypothesis로 지정하였고, 사후 검정을 위해 각 계통간 차이를 확인하기 위해 Tukey 분석(Tukey's HSD, Tukey's honestly significant difference test)을 실시하였으며(Tukey 1977) (Table 3), 육안 측정과 2n의 첫 반복군을 대조군으로 지정하여 Dunnett 검정(Dunnett's multiple comparison test)을 실시하였다(Tallarida & Murray 1987). 그 결과 Table 2와 같이 측정 결과는 계통에 영향을 받지 않는 반면, 배수체와 측정 방법은 결과에 유의미한 영향이 있는 것으로 보여진다. 각 계통에 대한 차이를 알아보기 위해 Tukey 분석 결과를 시각화한 결과, 시험에 사용된 계통들의 영향은 크지 않은 것으로 보여지며(Fig. 11), Dunnet 분석은 2n의 반복구 결과에 차이가 없지만, 2n과 n 그리고 육안 측정과 형광 이미지 분석의 결과에서는 유의미한 차이를 보였다.

Table 1

Comparison table of selection accuracy of haploid and diploid.

Population	Haploid (n) selection				Diploid (2n) selection
	Visual	Fluorescence (checked)	Accuracy		Visual	Fluorescence (checked)	Accuracy
HW9/HW1	50	44(1)	up 10%		100	96(1)	up 3%
HW9/14S8015	50	40(6)	up 8%		100	96(3)	up 1%
15S6339/15S6066	50	29(7)	up 28%		100	96(1)	up 3%
Gangwon35/NK6240	50	34(6)	up 20%		100	97(0)	up 3%
P1543/Sirus	50	35(6)	up 18%		100	99(0)	up 1%

Table 2

Summary of one-way analysis of variance test in each variable.

		Df	Sum square	Mean square	F value	Pr (>F)
Line		4	21.1	5.28	0.318	0.86270
	Residuals	25	843.7	33.75
Ploidy		1	240.0	240.00	10.76	0.00278**
	Residuals	28	624.8	22.31
Methods		1	235.2	235.20	10.46	0.00312**
	Residuals	28	629.6	22.49

^*, ^**, ^*** Statistically significant at the level of p<0.05, p<0.005, p<0.0005.

Table 3

Dunnett's test for ploidy types and methods.

	Comparisons	Diff	lwr.ciz	upr.ciy	p value
Ploidy	2n - 2n	-0.8	-5.807468	4.207468	0.9042
	n - 2n	-6.4	-11.407468	-1.392532	0.0113*
Methods	Eyes-Fluorescence	-5.6	-9.146819	-2.053181	0.0031**

^zlwr.ci: lower confidence interval.^yupr.ci: upper confidence interval.^*, ^**, ^*** Statistically significant at the level of p<0.05, p<0.005, p<0.0005.

Fig. 9. Fluorescence expression of maize seeds. (A) RGB image of Gangwon35 and HW9 line. (B) Fluorescence image included false-positive.

Fig. 10. Comparison of selection accuracy of haploid and diploid.

Fig. 11. Tukey HSD test plots for Lines. A is HW9/HW1; B is HW9/14S8015; C is 15S6339/15S6066; D is Gangwon35/NK6240; E is p1543/Sirus.

옥수수 육종에서 배가반수체 기술을 이용하는 것은 시간과 비용을 크게 절감할 수 있어 새로운 품종을 만드는데 매우 중요하다. 배가반수체 기술의 활용에서 가장 중요한 것 중의 하나는 반수체 종자를 선별하는 방법이다. 그러나 획득한 종자에서 비파괴적인 방법으로 반수체 유무를 확인하는 것은 아직까지 사람의 육안 판별법에 의존하고 있다. 이러한 육안 판별법은 반수체 종자는 R1-nj 유전자를 기반으로 안토시아닌 색소표지의 유무로 확인이 가능하지만 C1-I와 같은 안토시아닌 억제유전자로 인해 색소표지가 미세하게 나타나 사람의 육안으로 선발하는데 어려움을 겪고 있다. 본 논문에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 안토시아닌 성분의 형광 반응성을 이용하여 육안 판별법 대신 옥수수 반수체 종자를 선발하는 기술을 개발하였다. 강원도농업기술원 옥수수연구소에서 분양받은 5 집단에 대해 형광장치를 이용하여 반수체 및 배수체 종자를 선발한 결과 750립/1인 선별 기준 약 1시간 걸리는 작업량을 5분만에 시간단축을 할 수 있었고, 이러한 선발방법으로 반수체에서는 육안 판별법보다 평균 16.8%, 배수체에서는 2.2% 선발 정확도를 향상 시킬 수 있음을 확인하였다. 향후 디지털농업을 위한 기술개발로서 초분광 장치를 이용하여 파장별 정밀한 분석을 수행하고 반수체 및 배수체의 선발 정확도를 향상시키면 다양한 옥수수 품종 육성에 크게 활용될 것으로 판단된다.

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ01419901)의 지원에 의해 이루어진 것임.