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Agrobacterium-Mediated Transformation of Wheat
아그로박테리움 매개 밀 형질전환
Korean J. Breed. Sci. 2022;54(4):358-368
Published online December 1, 2022
© 2022 Korean Society of Breeding Science.

Eun Ji Park, Jae-Ryeong Sim, Yu-Jeong Yang, Saet Buyl Lee, Beom-Gi Kim, Sewon Kim*, and Jong-Yeol Lee*
박은지⋅심재령⋅양유정⋅이샛별⋅김범기⋅김세원*⋅이종열*

Metabolic Engineering Division, National Institute of Agricultural Science, Rural Development Administration, Jeonju, 54874, Republic of Korea
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부 생물소재공학과
Correspondence to: Jong-Yeol Lee (E-mail: jy0820@korea.kr, Tel: +82-63-238-4616, Fax: +82-63-238-4604)
Sewon Kim (E-mail: sewonk@korea.kr, Tel: +82-63-238-4635, Fax: +82-63-238-4604)
Received November 4, 2022; Revised November 12, 2022; Accepted November 14, 2022.
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the world's three staple crops and accounts for approximately 20% of the total calories consumed by the world's population. It is known that wheat is a difficult crop to introduce foreign genes into, having a large genome (16 Gb) containing three highly related subgenomes (AABBDD). Owing to the low transformation efficiency of wheat, it is difficult to apply new technologies such as genome editing and basic research based on molecular biology, such as the discovery of useful genes and functional analysis. Recently, the completion of a wheat genome map by the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) and the development of a stable and reproducible wheat transformation system have accelerated research regarding the expression and control of useful genes. In this review, we introduce in detail the recently developed highly efficient Agrobacterium-mediated wheat transformation system and its applications in plant biotechnology, such as RNA interference (RNAi), overexpression, and gene editing using this system.
Keywords : agrobacterium tumefaciens, genetic transformation, wheat
서 언

밀은 쌀, 옥수수와 함께 세계 3대 식량 작물 중 하나로 전 세계 인구가 소비하는 칼로리의 약 20%와 단백질 섭취량의 약 25%를 제공하는 작물이다(Shewry et al. 2009). 2017년 국제연합식량농업기구(Food and Agriculture Organization, FAO)는 2050년에 전 세계 인구가 98억 명으로 증가함에 따라 식량 생산량을 최소 50% 더 증가시켜야 한다고 보고하였다(FAO 2017). 현재 급속한 인구 증가와 기후변화에 대응하기 위해 생물학적 스트레스(Biotic stress)와 비생물생학적 스트레스(Abiotic stress)에 내성이 있는 품종 개발을 위한 새로운 육종기술들이 활용되고 있다. 또한, 소비자들의 생활수준 향상으로 건강한 밀에 대한 관심이 증가하고 있다. 생명공학 기술을 적용해 밀과 관련된 생물학적 스트레스(Biotic stress), 비생물학적 스트레스(Abiotic stress), 밀 관련 질환(Wheat-related disease) 등 여러가지 요인들을 개선한다면 높은 수확량 및 향상된 품질의 품종을 기대할 수 있다.

밀 관련 질환

밀 종실에서 저장 단백질은 전체의 약 8~15%를 구성하며 염 용해도에 따라 글루텐(gliadin, glutenin)과 비 글루텐 단백질(albumin, globulin)로 분류할 수 있다(Pasha et al. 2016). 글루텐은 저장단백질의 85%를 차지하고 밀반죽에 점탄성을 부여하여 빵, 면, 과자와 같은 가공식품으로 많이 이용된다(Wieser et al. 2007). 하지만, 글루텐 단백질은 일부 개인이 섭취했을 때 특정 질환을 유발할 수 있는 원인이 된다. 글루텐 단백질과 관련된 질환은 면역학적 발병기전에 따라 자가면역질환(셀리악병), 알러지 질환(밀 의존성 운동 유발성 과민증, 제빵사 천식 등), 비셀리악글루텐민감성(non-celiac gluten-sensitivity, NCGS)으로 나눌 수 있다(Cabanillas et al. 2020).

자가면역 질환인 셀리악병(Celiac disease, CD)은 전 세계 인구의 1~2%에 해당하는 질환으로 소장 내 글루텐 흡수를 저해해 염증이 일어나고 융모가 손상되면서 소화불량과 복통을 유발한다(Singh et al. 2018). 셀리악병은 유전적으로 HLA-DQ2 또는 HLA-DQ8과 같은 유전자를 가진 사람에게 유발되는 것으로 알려져 있으며 셀리악병을 앓고 있는 환자의 90%가 HLA-DQ2유전자를 보유하고 있다(Tye-Din et al. 2010, Li et al. 2014, Ozuna et al. 2015). 셀리악병의 주요 항원인 α-글리아딘의 대표적인 T세포 자극 항원 결정기는 PFPQPQLPY, PYPQPQLPY, PQPQLPYPQ, 및 FRPQQPYPQ이다(Tye-Din et al. 2010, Sollid et al. 2012). α-글리아딘에서 유래된 33-mer 글리아딘 펩타이드는 3개의 다른 유형의 항원결정기(DQ2.5-glia-α1a 1개, DQ2.5-glia-α1b 2개, DQ2.5-glia-α2 3개)가 중첩된 가장 유독한 펩타이드로 알려져 있다(Schalk et al. 2017). γ-글리아딘은 PQQSFPEQQ, IQPEQPAQL외 9개(Sollid et al. 2012), 그리고 ω1-, 2-글리아딘은 PFPQPQQPF, PQPQQPFPW의 항원결정기를 갖는다(Tye-Din et al. 2010). 셀리악병을 예방하는 유일한 방법은 밀을 완전히 배제해야 하는 글루텐 프리 식단으로 알려졌지만, 글루텐은 점탄성 및 결합 특성으로 많은 가공식품에 첨가되기 때문에 글루텐 프리 식단을 계속 유지하기 매우 어렵다. 이에 대한 대안으로 지금까지 셀리악병의 T 세포 자극 항원결정기가 저감된 밀 품종을 개발하기 위해 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 시스템과 CRISPR/Cas9 시스템과 같은 유전자 변형 방법이 적용되고 있다. 예로, RNAi 시스템을 유전자총 형질전환 방법을 이용해 글리아딘 유전자 발현을 97%까지 감소시켜 종자 발아 또는 반죽 품질에 영향을 미치지 않는 계통이 개발되었고(Gil-Humanes et al. 2010), Sánchez-León et al. (2018)는 CRISPR/Cas9 시스템을 유전자총 형질전환 방법을 활용하여 빵 밀에서 셀리악병에 주요 항원으로 알려진 α-글리아딘, γ-글리아딘을 각각 82%, 92% 감소시킨 품종을 개발하였다.

밀 알러지는 밀 의존 운동 유발성 과민증(Wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis, WDEIA)과 제빵사 천식(Baker's asthma) 등으로 나뉘며 전 세계 인구의 약 0.5~1%가 앓고 있는 질환이다(Taraghikhah et al. 2020, Wang et al. 2020). WDEIA는 밀 섭취 후 과격한 신체 운동을 할 경우 발생되는 식품 알레르기로, 두드러기에서 호흡기, 위장 또는 심혈관 증상에 이르는 아나필락시스 반응을 일으킨다. WDEIA와 관련된 주요한 항원은 ω5-글리아딘(ω-5 gliadin)과 고분자 글루테닌 서브유닛(high molecular weight glutenin subunits, HMW-GS)으로 알려져 있다(Scherf et al. 2016). 그 중 중심 항원인 ω5-글리아딘의 주요 항원 결정기는 QQFPQQQ, QQIPQQQ, QQSPQQQ 및 QQSPEQQ이고 HMW-GS는 QQPGQ, QQPGQGQQ 및 QQSGQGQ이다(Matsuo et al. 2004, Matsuo et al. 2005, Altenbach et al. 2018). 제빵사 천식은 밀가루가 호흡기관에 들어가 알러지를 유발하는 질환으로 α-amylase/trypsin inhibitors (ATIs)와 nonspecific lipid transfer proteins (nsLTPs)의 항원결정기에 의해 유발된다고 알려져 있다(Salcedo et al. 2011, Scherf et al. 2016).

NCGS는 셀리악병과 같은 자가면역질환은 아니지만 유사한 증상이 나타나며 글루텐 단백질 섭취로 인해 발생하는 질환이다. NCGS는 자가면역 또는 알러지와 같이 Immunoglobulin E (IgE) 반응에 관여한다는 근거는 없으며 NCGS의 발병기작은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, ATIs와 gliadins와 같은 특정 글루텐 단백질 성분이 질환을 유발하는 데 관여할 가능성이 있다고 알려져 있다(Zevallos et al. 2017, Cabanillas et al. 2020).

밀의 생물학적 스트레스

최근 지구 온난화로 인한 기온 상승으로 불리한 환경조건에서 다양한 생물학적 및 비생물학적 스트레스에 내성이 강한 작물 육종의 필요성이 커지고 있다. 생물학적 스트레스는 전 세계적으로 연간 작물 생산량의 11~30% 손실을 초래하여 세계 식량 안보를 위협한다(Savary et al. 2019, Lew et al. 2020). 생물학적 스트레스는 박테리아, 바이러스, 균류, 곤충 및 잡초에 의해 발생하며 작물의 수확량을 감소시키는 요인 중 하나이다. 밀은 다양한 병원체 및 해충에 의해 유발되는 100가지 이상의 다양한 식물병에 시달리고 있으며 주요 밀 식물병에는 녹병(rust), 흰가루병(powdery mildew), 붉은 곰팡이병(fusarium head blight) 등이 있다(Savary et al. 2019, Umar et al. 2021).

밀 녹병은 세계적으로 밀 수확량과 품질에 피해를 주는 대표적인 식물병 중 하나로 잎녹병(leaf rust), 줄녹병(stripe rust), 줄기녹병(stem rust)으로 분류된다. 녹병의 병원균에 따라 잎녹병균은 Puccinia triticina(Pt), 줄녹병균은 Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst), 줄기녹병균은 Puccinia graminis f. sp. tritici (Pgt)라는 병원균에 의해 발병하며 각각 Lr, YrSr로 표기된 유전자에 의해 저항성을 나타낸다(Cummins & Hiratsuka 2003). 하지만, 1998년 우간다에서 출현한 새로운 줄기 녹병균주인 Ug99 (TTKSK)와 그 외 RRTTF, TKTTF, TRTTF 병원균들이 이전에 알려진 저항성 유전자에 내성을 보이면서 밀 생산에 큰 위험요인이 되고 있다(Singh et al. 2011, Olivera et al. 2015).

흰가루병은 Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt) 병원균에 의해 발생하며 식물의 잎과 줄기에 흰가루 형태의 병반을 나타낸다. 흰가루병은 전 세계적으로 많이 발생하며 특히 중국, 유럽, 등 건조하고 서늘한 기후를 가진 지역에서 주로 발생한다(Dubin et al. 2011). 최근 몇 년 동안 흰가루병은 세계 각 지역에서 40%까지 증가했으며 수확량을 5~8%까지 감소시켰다(Singh et al. 2016). 매년 전 세계적으로 10억 달러 이상의 경제적 손실이 발생한다고 보고하였다(Menardo et al. 2017).

밀 붉은 곰팡이병은 주로 Fusarium graminearum에 의해 발생하는데 이 병원균에 감염되면 이삭이 갈색으로 변색되어 점차 붉은색을 나타낸다(Dean et al. 2012). 붉은 곰팡이병은 엽면 식물병과 달리 밀 이삭에 직접 발생하기 때문에 수확량과 품질에 큰 영향을 끼친다. 붉은곰팡이병은 주로 따뜻하고 습한 지역에서 발생하며 연간 56억 달러에 달하는 2,800만 톤의 곡물량을 감소시켰다(Savary et al. 2019, Wang et al. 2020). 우리나라에서는 1963년 남부지방에서 대발생하여 맥류 수확량의 40~80% 감소하여 사회적으로 큰 문제가 된 후(Chung 1975), 약 10년 주기로 대발생하는 것으로 알려져 있다(Park et al. 2012).

밀의 비생물학적 스트레스

비생물학적 스트레스에는 고온, 가뭄, 염분, 열, 냉해 및 UV 등이 있으며 곡물 품질과 작물 생산에 큰 영향을 미친다. 지구 온난화로 인해 가뭄은 전 세계적으로 밀 생산 지역에서 더욱 빈번하게 나타나며 작물 수확량에 영향을 미치는 광합성을 포함한 대사과정을 방해한다. 그 결과 작물의 생장기, 개화기 때 곡물을 감소시켜 생산량에 부정적인 영향을 준다(Shangguan et al. 1999, Subrahmanyam et al. 2006). 이 중 대표적인 밀 가뭄 스트레스로 인해서 미국은 연간 60억~80억 달러의 손실을 초래하고 있으며(Dai 2011, Fontaine et al. 2014). 고온, 가뭄 스트레스가 향후 유럽 전역에서 증가할 것으로 예상한다. 유럽은 세계 밀 생산량의 약 35%를 차지하고 있기 때문에 이러한 환경적인 영향은 식량안보에 큰 위협이 될 수 있다(FAOSTAT 2019).

온도 스트레스는 밀 발달 단계에 큰 영향을 미치는 요인이다. 밀의 발아는 온도 스트레스에 취약하고 종자는 주변 토양 온도가 변하면 변경된 대사 활동으로 인해 발아를 지연시켜 상당한 수확량 감소를 일으킨다. Asseng et al. (2011)는 평균 기온이 1°C 상승할 때마다 전 세계 밀 생산량이 6%씩 감소할 것이라고 예측했고 다른 연구에서는 온대 및 열대 지역에서 2°C 상승할 때마다 밀의 상당한 수확량 손실을 예측했다(Challinor et al. 2014).

염 스트레스는 전 세계적으로 경작지의 약 20%와 관개 농지의 약 33%에 영향을 미치며 2050년에 피해범위는 경작지의 50%이상 증가할 것으로 예상된다(Ashraf et al. 2009, Shrivastava et al. 2015). 염분 농도가 높고 물이 부족한 토양은 종자의 수분 흡수 능력을 저해해 종자의 발아를 지연시켜 나아가 수확 밀도 감소로 인한 잠재적인 수확량 손실을 초래할 수 있다(Shrivastava et al. 2015).

밀에 영향을 미치는 저해 요소들을 극복해 식물병, 비생물학적 스트레스를 위해 다양한 육종 방법이 활용되고 있지만, 밀의 배수성, 높은 비율의 반복 서열, 큰 유전체 크기로 타 작물에 비해 부진한 상황이다(Slade et al. 2005). 최근에는 이러한 새로운 저항성 유전자를 빠르고 정확하게 선별해 내기 위해 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)기반에 MutRenSeq, AgRenSeq, MutChromSeq과 같은 기술들이 적용되고 있다(Zhang et al. 2020). 유용한 외래 유전자를 도입하여 원하는 형질을 발현시키는 유전자 변형 기술은 기존의 전통 육종 방식을 보완할 수 있는 기술로 유전체 정보, 유전자가위를 이용해 신육종기술에 적용해 유전자변형생물(genetically modified organism, GMO), 유전자 교정 식물체와 같은 형질전환체가 개발되었다. 유전자 변형을 위해서는 형질전환 기술이 불가피하며 대부분 밀에서 아그로박테리움 형질전환 방법과 유전자총 형질전환 방법이 가장 많이 적용되고 있다. 그중 아그로박테리움 형질전환 방법은 식물 형질전환에 대한 직접적인 접근법으로 소수의 중복 삽입된 유전자만 세대를 거쳐 안정적인 편집 효율을 보인다는 장점이 있다. 이러한 외래 유전자의 안정적인 유전과 발현은 농업에 있어서 중요한 이점이다(Travella et al. 2005).

밀에 적용되고 있는 유전자 교정 기술

빵밀은 Triticum urartu (2 n=2x=14, genome AA), Aegilops speltoides (2 n=2x=14, genome BB) 및 Aegilops tauschii (2 n= 2x=14, genome DD)의 교배로 21개의 염색체 쌍으로 구성된 이질육배체(allohexaploid, 2 n=6x=42, AABBDD) 빵밀이 되었다. 일반 밀(Triticum aestivum L.)은 잦은 반복 서열(>80%)을 지니며, 크고 복잡한 배수체 게놈(16Gb)의 특성으로 인해 형질전환이 어려웠다(Garbus et al. 2015). 하지만, 2018년에는 밀 참조 게놈 International Wheat Genome Sequencing Consrotium (IWGSC) RefSeq v.1.0와 2021년에는 IWGSC RefSeq v2.1가 발표되었으며(Appels et al. 2018, Zhu et al. 2021), 생명공학기술의 발달로 유용한 유전자를 식물체에 도입하는 새로운 형질전환 기술이 개발되었다. 최근에는 알려진 유전자 정보를 바탕으로 유전자 교정(gene editing) 기술과 같은 다양한 정밀 육종 기술이 밀 작물의 농업 형질을 개선하기 위해 적용되고 있다.

유전자 교정 기술의 빠른 발전으로 1세대인 ZFN (Zinc finger nucleases)과 2세대 TALEN(TAL effector nuclease)과 다르게 3세대 CRISPR/Cas9 시스템은 간단하고 효율적인 유전자 교정을 가능하게 하여 많은 실험에 적용하고 있다(Jinek et al. 2012, Kumar et al. 2019). CRISPR/Cas9 시스템은 지금까지 농업에서 중요한 작물 종에 성공적으로 적용된 유전자 교정 도구로 작물의 수확량, 품질, 생물학적 및 비생물학적 스트레스 내성 등을 개선할 수 있는 유용한 기술이다(Chen et al. 2019). 유전자 교정 기술은 유전체에서 특정 DNA 단편의 제거 또는 삽입을 통해 작물의 형질을 개선하는 유용하고 실용적인 도구로 Sequence-specific nucleases (SSNs)을 사용하여 DNA에 Double strand break (DSB)를 생성하는 원리이다. 이때 Non-homologous end joining (NHEJ) 또는 Homologous recombination (HR)이라는 두가지 수선 방법에 따라 돌연변이 양상이 달라진다(Lieber et al. 2010, Zhang et al. 2018). 최근에는 CRISPR/Cas12a (Cpf1), Base editors (BEs), Prime editors (PEs) 등 다양한 Cas9 이종상동체(orthologs)를 이용해 표적 효율성을 높이고 표적 외 돌연변이를 감소시켰다(Anzalone et al. 2019, Li et al. 2021). 또한, GMO 규제를 벗어나기 위해 시험관 내 전사체(in vitro transcripts, IVT)를 일시적으로 발현시킨 Cas9-coding sequence와 CRISPR/Cas9 DNA 또는 Ribonucleoprotein (RNP)을 미성숙 배아에 전달함으로써 외래유전자가 없는 형질전환체가 개발되었다(Zhang et al. 2016, Liang et al. 2017).

이러한 유전자 교정 기술을 적용하기 위해서는 형질전환 과정이 필수적이다. 식물의 형질전환은 원하는 DNA를 생명체의 유전체 내로 삽입하여 새로운 유전형질을 발현시키는 방법으로 아그로박테리움을 이용하는 방법(Agrobacterium mediated transformation), 유전자총(Particle bombardment), polyethylene glycol (PEG) 전이법, 미세주입법(Microinjection), 전기천공법(Electroporation) 등의 방법들이 있다. 본 총설에서는 아그로박테리움을 활용한 밀 형질전환 연구방법과 이를 응용한 연구결과에 관해 기술할 예정이다.

밀 아그로박테리움 형질전환

아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)은 다양한 식물 종에서 근두암종병이라고 하는 종양을 감염시키는 토양에 존재하는 그람 음성 박테리아이다. Agrobacterium ssp.는 상처에 의해 숙주인 식물 세포에 침투해서 Ti (tumor-inducing) DNA 중 일부인 T-DNA를 전달하는 능력이 있다. 이러한 능력을 이용하여 작물형질전환에 활용하였다. 식물 병원균인 아그로박테리움이 지니고 있는 Ti 플라스미드의 T-DNA 영역에 원하는 유전자를 넣어 재조합 운반체를 제작한 다음 아그로박테리움에 도입하여 공동배양(co-cultivation)하게 된다. 이후 조직배양을 통해 선발 마커가 포함된 배지에서 선발하고 재분화 과정을 거쳐 형질전환체를 만든다(Fig. 1). 1997년 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법이 최초로 보고되었다(Cheng et al. 1997). 그러나 이러한 아그로박테리움을 이용한 성공적인 형질전환 보고에도 불구하고 대부분의 실험에서 약 5%의 낮은 형질전환 효율을 나타냈다(Bhalla et al. 2006, Harwood et al. 2012, Li et al. 2012). 이후, Japan Tobacco Inc는 ‘Fielder’ 품종으로 PureWheat 기술을 개발해 40~90% 효율을 달성했지만(Ishida et al. 2015), 보통의 실험실에서 적용하기 어려웠기 때문에 이를 극복하기 위해 최근에 Hayta et al. (2021)는 'Fielder' 밀 품종에서 최대 33% 형질전환 효율이 증대된 아그로박테리움 형질전환 방법을 개발했다.

Fig. 1. A scheme of Agrobacterium-mediated gene transformation in wheat.

본 연구팀에서는 편집 효율이 높은 John Innes Centre의 방법을(Hayta et al. 2021, Smedley et al. 2021) 토대로 밀 형질전환 방법을 수행하고 있다. Figs. 2, 3에서 나타난 바와 같이 밀 개화 후 14일된 종자에서 미성숙 배아 적출, 캘러스 유도, 아그로박테리움 감염, 공동배양, 형질전환체 선발, 재분화, 순화 등의 순서로 수행하였다. 자세한 형질전환 방법은 아래와 같이 기술하였다.

Fig. 2. Developmental stages of immature seed in wheat.

Fig. 3. Main steps of the Agrobacterium-mediated wheat transformation. (A) inoculation and co-cultivation, (B) callus initiation on callus induction medium, (C) callus induction on selection media, (E) regeneration of transgenic plants with WRM medium, (F) transgenic wheat plants transferred to culture tube showing strong root system in hygromycin medium.

아그로박테리움 형질전환 활용한 운반체는 pGoldenGreenGate-MoClo (pGGG-M)을 사용하였다(Smedley et al. 2021). pGGG-M 운반체는 IIS 타입 제한효소를 매개로하는 골든 게이트(Golden Gate, GG) 모듈식 클로닝 시스템이다. 다중 유전자 binary 운반체인 Level 2 운반체(pGGG-M L2 acceptor)에 유전자 발현 카세트인 Level 1 운반체들을 (OsActinP:hpt-int:35sT, L1P1; OsUbiP:Cas9:NosT, L1P2; TaU6P:sgRNA1, L1P3; TaU6P: sgRNA2, L1P4; end-linker 4, L1) 조립하여 pGGG-L2-CRISPR를 제작하였다. pGGG-L2-CRISPR 운반체와 VirG gene을 포함하는 pSoup의 helper plasmid를 Agrobacterium tumefaciens 균주 AGL1에 삽입하였고, 이후 밀 아그로박테리움 형질전환에 사용하였다.

밀 개화 후 14일 된 미성숙 종자는 70% 에탄올과 20% 락스로 소독하고 멸균수로 세척한 후 소독한 미성숙 종자에서 미성숙 배아를 적출하여 1 mL wheat inoculation medium (WIM 배지, 0.44 g/L MS, 10 g/L Glucose, 0.5 g/L MES)에 0.05% Silwet L-77을 포함하는 1.5 mL 튜브에 넣어둔다. 이후 4°C에서 10분 동안 14,000rpm으로 원심분리 후, 0.05% Silwet L-77을 포함하는 WIM 배지를 제거하고 제작한 운반체가 포함된 아그로박테리움에 넣어 30초 동안 위 아래로 흔들어 준 뒤 실온에서 최소 20분 동안 배양한다. 아그로박테리움이 처리된 미성숙 배아는 wheat co-cultivation 배지(0.44 g/L MS, 10 g/L Glucose, 0.5 g/L MES, 100 μM AS, 5 µM AgNO3, 1.25 mg/L CuSO4⋅5H2O, 8 g/L Agarose)에 배축이 위로 향하게 치상하여 24±1°C의 암조건에서 3일 동안 공동배양했다(Fig. 3A).

2~3일간 공동배양 후, 미성숙 배아의 배축을 제거하고 Wheat callus induction medium (WCI 배지, 4.3 g/L MS, 30 g/L Maltose, 1 g/L Casein hydrolysate, 10 mL 100x Vitamin stock, 2 mg/L Picloram, 0.5 mg/L 2,4-D, 1.25 mg/L CuSO4⋅5H2O, 160 mg/L Timentin, 5 g/L Agarose)로 옮겨 24±1°C의 암조건에서 캘러스(callus)를 유도하기 위해 5일 동안 배양한다(Fig. 3B). 이후 유전자 교정 식물체를 선발하기 위해 15 mg/L Hygromycin이 첨가된 1차 선발배지로 옮겨 24±1°C의 암실에서 2주 동안 배양하고(Fig. 3C). 선발된 캘러스의 2차 선발을 위해 30 mg/L Hygromycin이 첨가된 배지에서 2주 동안 배양한다(Fig. 3D). 2주 후 16시간 광조건에서 가림막으로 덮어 1주일 동안 배양하면 캘러스의 녹점이 발생한다. 이후 wheat regeneration medium (WRM 배지, 4.3 g/L MS, 30 mg/L Maltose, 1 g/L Casein hydrolysate, 10 mL 100x Vitamin stock, 1 mg/L Zeatin, 1.25 mg/L CuSO4⋅5H2O, 160 mg/L Timentin, 20 mg/L Hygromycin, 5 g/L Agarose)에서 재분화를 유도하기 위해 16시간 광조건에서 배양한다(Fig. 3E). 재분화 된 식물체의 뿌리 길이가 1~2 cm정도 자라면 8 mL의 WCI 배지가 담긴 De Wit 튜브(Duchefa, W1607) (8 mL WCI, 4 g/L Agarose, 160 mg/L Timentin, 15 mg/L Hygromycin)에 옮겨 뿌리를 유도하고 성체가 된 유전자 교정 식물체를 순화시킨 후 온실로 옮겨 준다(Fig. 3F).

지금까지 밀의 아그로박테리움 형질전환 효율에 영향을 미치는 인자를 조사한 연구에 따르면, 아그로박테리움 형질전환은 여러가지 요인에 의해 형질전환 효율이 달라진다. 그 요인에는 아그로박테리움 균주, 운반체, 아그로박테리움 농도, 아그로박테리움 현탁배지, 숙주 식물 종의 생리학적 상태 및 공동 재배 조건 등이 있다(Hiei et al. 2014). 또한, 밀의 유전자 교정 식물체 제작은 낮은 유전자형의 변형과 식물 재분화 효율로 인해 제한되는데, 이러한 현상을 극복하기 위해 체세포 배 발생, 기관 발생 및 식물 재생에 관여하는 다양한 식물 발달 유전자(Plant development regulators)가 연구되었다. 최근에는 밀에 Growth regulating factor 4 (GRF4)와 그 보조인자 GRF-Interacting factor 1 (GIF1) 복합체의 발현이 밀 형질전환체의 재생 효율(77.5%)과 속도를 증가시켰다(Debernardi et al. 2020). Qiu et al. (2022)TaGRF4의 MicroRNA396 (miR396)에 돌연변이를 유발해 GRF-GIF의 활성을 증가로 형질전환 효율이 2~9배 증가하였다.

아그로박테리움 매개 밀 형질전환 연구현황

아그로박테리움을 이용한 밀 형질전환 사례는 Table 1에 정리하였다. 밀 형질전환사례들은 표적 유전자의 과발현, RNAi, CRISPR/Cas9 시스템 기반으로 비생물학적 스트레스, 생물학적 스트레스, 수확량, 밀 관련 질환 등에 적용되었다.

Table 1

List of research status through Agrobacterium-mediated wheat transformation.

Target gene(s) Cultivar or genotype Expression
type
System Description Agrobacterium
(strain)
Promoter Reference
Abiotic stress TtLEA2-1 1718 Overexpression Salt tolerance EHA105 CaMV, 35S Yang et al. 2022
TaWRKY2 Fielder Overexpression Drought Stress Tolerance GV3101 Ubi Gao et al. 2018
SeCspA KN199 Overexpression Drought Stress Tolerance EHA105 CaMV, 35S, Ubi Yu et al. 2017
TaMBF1c CB037 Overexpression Thermo tolerance EHA105 Ubi Tian et al. 2022
Knock down RNAi
Knock out CRISPR/Cas9
Plant disease Sr22, Sr35, Sr45, Sr50, Sr55 Fielder Overexpression Resistance to a fungal rust patdogen GV3101 35S Luo et al. 2021
Speed breeding Ms1 Fielder, Gladius Knock out CRISPR/Cas9 Promoted male fertility AGL1 TaU6 Okada et al. 2019
Ms2 DMSW Knock out CRISPR/Cas9 Male fertility restoration C58C1 TaU3 Tang et al. 2021
TaMs45 Fielder, SBC0456D Knock out CRISPR/Cas9 Promoted Male sterile LBA4404 TaU6 Singh et al. 2018
TaMTL Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Efficient induction of haploid plants C58C1 TaU3 Liu et al. 2020
Yields and grain quality TaCKX2-1 Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Increased grain number per spikelet EHA105 TaU6 Zhang et al. 2019
TaAQ Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Altered spike shape, flowering time, glume angle, glume tenacity, rachis fragility, and seed threshability C58C1 TaU3 Liu et al. 2020
TaDq Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Altered plant height C58C1 TaU3 Liu et al. 2020
TaQsd1 Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Enhanced Seed dormancy levels EHA101 OsU6 Abe et al. 2019
TaPDS Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Function results in a photobleaching phenotype AGL1 TaU3, TaU6, OsU3 Howells et al. 2018
Wheat-related disease α-, γ-gliadins Fielder Knock out CRISPR/Cas9 Reduced immunogenic epitopes for CD AGL1 TaU6 Jouanin et al. 2019


비생물학적 스트레스와 관련된 연구에서는 활성산소를 감소시켜 비생물학적 스트레스에서 세포를 보호하는 Late embryogenesis-abundant (LEA) 유전자를 밀에 과발현시켜 염분에 저항성을 향상시켰다(Yang et al. 2022). WRKY 전사인자 (transcription factors, TFs)는 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 향상시키고 식물의 성장과 발달을 조절한다고 알려져 있다. 밀 ‘Fielder’ 품종에 TaWRKY2 유전자를 과발현시킨 식물체는 가뭄 스트레스 조건에서 프롤린(Proline), 수용성 당과 같은 삼투조절물질의 증가로 인한 높아진 수분흡수율과 스트레스 관련 유전자의 발현 증가로 가뭄 스트레스 저항성과 곡물 수확량을 증가시켰다(Gao et al. 2018). 또한, 저온 조건에서 세균의 세포를 보호하는 Cold shock protein (CSP)유전자를 과발현시킨 SeCspA 과발현식물체는 가뭄 스트레스 조건하에서 식물호르몬 abscisic acid (ABA)와 프롤린의 증가로 수분 손실률이 감소하여 가뭄에 대한 내성과 수확량을 증가시켰다(Yu et al. 2017). 열 스트레스는 전 세계적으로 작물 수확량 손실을 심각하게 유발하는 주요 요인이다. Multiprotein Bridging Factor 1 (MBF1)은 c-Jun, GCN4, FTZ-F1, Ad4BPATF1와 같은 전사인자를 조절하는 활성 보조 인자로 TATA-box 결합 단백질(TATA-binding protein, TBP)과 상호작용하여 유전자의 전사 발현을 촉진한다. 열 스트레스와 관련된 TaMBF1c를 표적 유전자로 CRISPR/Cas9과 RNAi 시스템을 통해 열 스트레스 저항성이 증가한 형질전환체를 제작하였다(Tian et al. 2022).

생물학적 스트레스 관련 연구에서는, 녹병 저항성 유전자인 Sr22, Sr35, Sr45, Sr50, Sr55를 ‘Fielder’ 품종에 과발현시킨 식물체가 녹병균인 Puccinia graminis에 대해 강한 내성을 보였다(Luo et al. 2021). 웅성 불임 돌연변이는 제웅의 과정을 생략할 수 있어 단 시간 내 대량 생산을 할 수 있으며 병 저항성이나 수확량이 뛰어난 잡종 종자를 재배할 수 있는 이점이 있다. 꽃가루 엑신 발달과 웅성 생식능력에 영향을 미치는 Male Sterility 1 (Ms1) 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템 기반으로 웅성 돌연변이체를 유도했다. 이후, 제작한 열성 Ms1 유전자 교정 식물체는 T3 세대까지 웅성 불임을 나타냈다(Okada et al. 2019). 또한, 다른 웅성 불임 유전자인 Male sterile 2 (Ms2) 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템 기반으로 웅성불임 계통인 DMSW (dwarf male‐sterile wheat)에 돌연변이를 유발했고 9%의 편집효율로 웅성 생식능력이 회복된 유전자 교정 식물체를 생산했다(Tang et al. 2021). 옥수수 Male sterile 45 (Ms45) 유전자는 strictosidine-like 합성 효소를 암호화하며 웅성 생식능력에 기여한다. Ms45 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 밀에 형질전환시킨 결과 돌연변이가 유발된 삼중 동형 접합체(triple homozygous plant)만 웅성 불임이 되었다. 결과적으로 밀에 Ms45 동종체(homeologs)는 모두 웅성 생식능력에 기여하기 때문에 웅성 불임을 유발하기 위해선 삼중 동형 접합 돌연변이가 필요하다(Singh et al. 2018). 또한, 반수체(haploid)가 배가반수체(doubled haploid, DH)를 형성하게 되면 상동염색체가 동형(homozygous)으로 단기간에 순계화가 가능해 육종에 걸리는 시간을 단축할 수 있는 장점이 있다. Liu et al. (2020a)는 꽃가루 생성에 특이적인 인지질가수분해효소(phospholipase)인 TaMTL (Matrilineal) 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 유전자 교정 식물체를 제작하였고, T1 세대에서 반수체가 18.9% 유도되어 단기간에 순계화가 가능해 육종 시간을 단축할 있다.

밀 곡물의 수확량과 품질 향상을 위한 연구에서는, 사이토키닌 산화효소/탈수소효소(Cytokinin oxidase/dehydrogenase, CKX)를 암호화하며 밀의 이삭당 곡물 수를 감소시키는 TaCKX2-1 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 ‘Fielder’ 품종에 형질전환 하였고, 평균 10%의 편집효율로 이삭 당 종자 수(Grain number per spikelet)가 증가한 유전자 교정 식물체를 생산했다(Zhang et al. 2019). 작물의 수확량은 식물 높이, 이삭 구조, 개화시기 및 꽃 구조 등 작물의 농업형질과 밀접하게 연관되어 있다. 식물의 성장과 발달 조절에 중요한 역할을 하는 AP2 (APETALA2)-like 전사인자 중 하나인 TaQ 대립유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 형질전환체를 제작했다. 그 결과 TaAQ, TaDq 유전자의 기능이 상실된 형질전환체는 이삭 모양, 식물 신장, 탈립성 등에 영향을 미쳤다(Liu et al. 2020b). 종자의 휴면성(Dormancy)은 높은 온도와 강우량으로 인한 수발아(Pre-harvest sprouting, PHS)를 방지해 작물의 수확량과 품질에 중요한 특성 중 하나이다. Abe et al. (2019)는 CRISPR/Cas9을 이용해 종자의 휴면을 조절하는 TaQsd1 (Quantitative trait locus on seed dormancy 1)을 표적 유전자로 돌연변이를 유발하여 삼중 열성 돌연변이를 생산하였다. 이 돌연변이는 야생형 대비 종자의 휴면 기간을 더 늘려 수발아를 방지한다(Abe et al. 2019). Howells et al. (2018)는 효율적인 표현형 선발을 위해 피토엔(Phytoene)을 제타 카로틴(Zeta-carotene)으로 불포화시키는 카로티노이드(Carotinoid) 경로 효소인 TaPDS (Phytoene desaturase) 유전자를 타겟으로 CRISPR/Cas9을 이용해 형질전환체를 제작하였다. 형질전환체는 엽록소를 합성할 수 없어 백색(Albino)을 나타나게 된다.

밀 질환과 관련된 연구에서는, 셀리악병의 원인이 되는 α-, γ-글리아딘을 저감시키기 위해 CRISPR/Cas9 기술을 이용해 빵 밀에서 6개의 sgRNA를 제작해 α- 및 γ-글리아딘을 표적 유전자로 형질전환체를 제작했다. 글리아딘 단백질을 분석하기 위해 A-PAGE로 단백질을 분리한 결과 야생형과 비교해서 T1 식물체의 글리아딘 단백질이 저감되었다. 셀리악병은 α-, γ- 및 ω-글리아딘에 존재하는 항원결정기에 의해 유발되기 때문에 유전자 교정 기술을 이용해 저감시킬 수 있다(Jouanin et al. 2019).

식물체의 유전적 변이를 만드는 것은 지속 가능한 농업 생산을 위한 새로운 작물 품종을 육종하는 데 필수적인 부분이다. 생명공학 기술의 급속한 발전으로 이전 EMS (ethyl-methane-sulfonate)유도 및 방사선과 같은 전통적인 무작위 돌연변이 유발 방법에서 밀 유전체 서열의 정확한 수선을 가능하게 하는 유전자 교정 방법으로 발전했다 현재 유전자 교정과 RNAi와 같은 다양한 생명공학기술들을 밀에 적용해 식물병, 비생물학적 스트레스, 밀 관련 질환을 개선하기 위한 연구들이 진행되고 있다.

적 요

밀(Triticum aestivum L.) 은 세계 3대 작물 중 하나로 전 세계 인구가 소비하는 총 열량의 약 20%를 담당하는 매우 중요한 식량작물이다. 하지만, 밀은 세가지 상동게놈으로 이질육배체(allohexaploid)를 이루고 일곱쌍의 염색체로 각각 이루어져 있으며, 매우 거대한 약 16 Gb의 게놈 크기로 인해 다른 작물들에 비해 외래의 유전자를 받아들이기 어렵다고 알려져 있다. 이러한 밀의 낮은 형질전환 효율로 유용 유전자 발굴, 기능 분석 등 분자생물학 기반 기초연구와 유전자 교정(genome editing)과 같은 새로운 기술 적용에 어려움이 있다. 최근 국제 밀 게놈 시퀀싱 컨소시움 (IWGSC: International Wheat Genome Sequencing Consortium)에 의한 밀 게놈 지도의 완성과 안정적이며 재현성이 높은 밀 형질전환 기술의 발전으로 유용 유전자의 발현 조절 연구가 본격적으로 진행되고 있다. 본 총설에서는 최근에 개발된 고효율의 아그로박테리움 밀 형질전환 방법을 자세히 소개하고 이를 이용하여 RNA 간섭(RNAi), 과발현 및 유전자교정과 같은 생명공학기술에 적용한 연구결과들을 소개하고자 한다.

사 사

본 논문은 농촌진흥청 차세대 농작물 신육종 기술 개발 사업 (PJ01652802)의 지원에 의해이루어진 것임.

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December 2022, 54 (4)
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