국화는 화훼시장에서 장미에 이어 두 번째 시장을 차지하는 화훼류로 특히 일본에서는 장미와 백합보다 더 수익을 내는 화훼류이다(Aida et al. 2005). 국내에서는 장미 다음으로 판매 우위를 점하고 있으나 시중에 유통되는 것은 대부분 외국품종으로 알려져 있다. 국내의 재배 면적 및 생산액이 국내 1-2위를 차지 하고 있는 중요 화훼작물이지만 현재까지 품종육성은 주로 교배육종에 의존하고 있다(Kang et al. 2011). 반면 네덜란드 등의 화훼선진국은 교배육종외에도 돌연변이 육종을 도입하여 상품가치를 올리고 품종육성 또한 민간회사 중심으로 이뤄지고 있다(Lee et al. 2013). 전세계적으로 절화와 화분식물의 시장은 항상 꽃색, 화형, 병저항성 등 특이하고 유용한 형질을 가진 품종을 찾고 있다. 이렇게 소비자가 원하는 형질중 일반 교배육종이나 돌연변이 육종이 제한적인 형질의 경우 생명공학적 기법이 필요한 것으로 간주되고 있다.

수 년 동안 많은 프로모터들이 다양한 작물에서 분리되어서 형질전환에 응용되었다. 도입유전자의 발현과 발현양상을 구명할 때 식물의 유전적 백그라운드와 도입유전자에 따른 적절한 프로모터의 조합이 반드시 필요하다. 유전자발현을 확인할 수 있는 데에는 프로모터의 사용과 효율적인 선택에 따라 좌우 될 수 있으며 단일식물에서 동일한 프로모터에 의해 다양한 형질전환체를 만들 수 있다(Villao-Uzho et al. 2023). 또한 식물에서 동일한 프로모터 하에 여러 개의 유전자를 발현시켰을 때 프로모터가 활성이 높은 경우에는 homology dependent gene silencing을 발생하는 경우도 있다(Potenza et al. 2004). 유도 프로모터나 특정 발현용 프로모터는 연구나 상용화에 반드시 필요해서 유전자 형질전환에 적절히 사용가능한 프로모터를 확보하는 것은 반드시 필요한 일이라고 할 수 있다. 일반적으로 많이 사용하는 35S-CaMV 프로모터의 경우 유전자 발현에 매우 효과적이어서 국화를 비롯한 쌍자엽류에 많이 사용되고 있다(Dong et al. 2014, Kim et al. 2018). 그러나 35S-CaMV 프로모터로 유전자를 도입한 국화의 경우 매우 낮은 발현을 보인다고 여러 그룹에서 보고되었다(Annadana et al. 2002). 이러한 결과는 유전자 삽입시 위치에 따른 차이 일 수도 있지만 국화의 유전자 도입의 경우는 효율이 낮을 것으로 추정된다(Aida et al. 2004). 국화나 타 작물의 프로모터를 이용하여 국화에서 유용하게 쓸 수 있는 프로모터를 개발하고자하는 시도는 여러 번 있었다. 국화에서 분리한 UEP1 gene (Ubiquitin extension protein1) 프로모터는 화기에서 주로 발현하였으며 일반적으로 사용하는 35S-CaMV 프로모터와 비교했을 때 40-85배 발현이 증가하였다(Annadana et al. 2002). 다른 작물의 프로모터를 이용한 경우는 감자의 Lhca3.St1 유전자의 프로모터(Noda et al. 2013), 담배 EF1αl 유전자의 프로모터(Aida et al. 2005), 아그로박테리움에서 분리한 mannopine synthase-1’과 2‘의 프로모터 등(Shinoyama et al. 2012)이 전신발현 프로모터로 국화에 적용된 바가 있다. 또한 토마토의 ACC oxidase (LEACO1)유전자의 유도성 프로모터나(Khodakovskaya et al. 2009), 스트레스에 의해 유도되는 rd29A의 프로모터(Ma et al. 2010)가 국화조직에서의 발현을 보고하였다. 본 논문에서는 국화의 전사체 정보를 기반으로 하여 전신발현하는 유전자의 프로모터를 분리하여 국화에서 안정적으로 사용가능한 프로모터를 발굴하고 그 활용성을 구명하고자 하였다.

식물재료

프로모터 분리에 사용한 국화(Chrysanthemum morifolium Ramat)는 국립원예특작과학원에서 육성한 화이트 윙 품종(white wing, WW)을 이용하여 국립농업과학원 온실에서 가을에 정식하여 재배하였다. 국화에서 전신발현 유전자의 후보는 국립농업과학원 유전체과에서 수행한 2배체 국화(Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino, 2n)의 전사체 분석결과를 기반으로 선정하였다(unpublished).

선정유전자의 국화 기관별 발현 확인

국화 전사체 분석 데이터 베이스에서 50개의 유전자(5’-UnTranslatedRegion 1-50)를 선발했고 선발한 대상 유전자의 부분 염기서열을 대상으로 화이트 윙 국화의 각 기관에서 발현을 확인하였다(Supplementary Fig. 1). 전신발현 분석은 국화의 기관(잎, 꽃봉오리, 뿌리, 엽병, 줄기)로부터 Total RNA를 분리한 후 50개 유전자 프라이머를 이용하여 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)로 확인하였다(Supplementary Table 1). 이때 꽃봉오리는 눈이 보이는 시점(대략 1 mm)부터 꽃잎이 보이는 시점까지를 모아서 사용하였다.

Fig. 1. The list of constitutively expressed genes and the expression pattern in chrysanthemum organs by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). RT-PCR expression assays were performed using five organ types: leaf, bud mix, root, petiole and stem, listed above the corresponding columns. Ribosomal RNA was used as a positive control for RT-PCR, and the results are shown in the bottom. U, 5’-Un Translated Region (UTR); M, size marker, L, Leaf; B, Bud mix; R, Root; P, petiole; S, stem.

프로모터 영역의 분리 및 벡터 제작

전체 기관에서 발현을 확인한 9개의 유전자(Fig. 1)의 프로모터 영역을 아래와 같이 분리하였다. 화이트 윙 국화의 어린 잎을 채취하여 액체질소를 이용하여 마쇄한 다음 QIAGEN Plant kit (Germany)로 게놈 DNA를 추출하였다. 유전자의 프로모터 영역은 genome walking kit (clontech, Japan)를 이용하였고 분리에 사용한 유전자의 GSP (gene specific primer)는 2배체 국화 전사체의 염기서열로 작성하였다. 분리한 프로모터 영역은 pGEM-T벡터(Promega, USA)로 삽입하여 전체 염기서열을 얻은 후 New PLACE (www.dna.affrc.go.jp)로 cis-acting elements를 분석하였다. 국화와 담배에서의 프로모터 발현 확인을 위해서 pCAMBIA1390 벡터의 항생제 부위를 NPT Ⅱ 마커로 치환한 벡터에 프로모터와 GUS (β-glucuronidase)를 연결하여 제작한 다음 Agrobacterium stain LBA4404로 도입하여 사용하였다.

담배와 국화 형질전환 및 형질전환체 확인

담배형질전환은 Horsh et al. (1985) 의 방법을 변형한 leaf disk 방법을 사용하였다. 기내에서 키운 담배(Nicotiana tabacum, Xanthi)의 잎을 약 5 mm정도 사각형이 되게 자른 후 pre-culture 배지에 암조건에서 2일간 배양하였다. 그 사이에 프로모터 벡터를 포함한 아그로박테리움을 액체배지에서 미리 키운 다음(2-3일) 약 1.5 mL정도를 100 mL의 배지에서 다시 접종하여 OD₆₀₀=1.0 정도가 되게 키워 수확하였다. 원심분리로 가라앉힌 펠렛을 공동배양배지에 희석한 후 preculture 식물체에 약 10분간 침지한 다음 물기를 제거하고 캘러스 유기배지에 이틀간 암배양하였다. 이틀 후 공동배양한 잎조각을 항생제 배지로 옮겨 7일간 아그로박테리움을 제거하고 shoots selection 배지로 옮겨 선발하였다. 전 과정에 걸쳐 배지에 사용한 호르몬은 NAA 2 mg⋅L^-1, BA 0.5 mg⋅L^-1로 사용하였으며 선발항생제는 kanamycin 50 mg⋅L^-1, cefotaxime은 250 mg⋅L^-1로 사용하였다. 국화는 프로모터 분리에 사용한 동일한 품종인 화이트 윙을 사용하여 Suh et al. (2020)의 방법에 따라 수행하였다. 배지조성은 전 과정에 걸쳐 IAA 0.5 mg⋅L^-1, BA 0.5 mg⋅L^-1로 사용하였으며 공동배양 이후 cefotaxime은 400 mg⋅L^-1로 사용하였고 shoot선발에 사용한 kanamycin은 15 mg⋅L^-1로 하였다. 국화형질전환에서는 shoot선발후 root배지에서 2차선발을 수행하였는데 이때 사용한 kanamycin 농도는 20 mg⋅L^-1로 하였다. 담배와 국화 모두 발근한 shoot에서 채취한 잎 3-4매를 가지고 게놈 DNA추출(GeneALL, Korea)을 수행하였다. 형질전환체 선발은 NPT Ⅱ primer (Forward: 5'- GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG -3', Reverse : 5' -ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA -3')로 EmeraldAmp ® PCR Master Mix (TaKaRa, Japan)를 이용하여 PCR반응(98°C에서 2분 denaturation 후 98°C 10초, 55°C 30초, 72°C 1분으로 35 cycle 후 72°C 5분 extention)으로 수행하였다.

Histochemical 분석

담배 및 국화 기관별 GUS활성은 GUS용액(De Block & Debrouwer 1992)을 이용하여 확인하였다. 이때 형질 전환이 되지 않은 조직에서 내생 GUS의 유사발현을 억제하기 위해서 20% methanol을 첨가하여 사용하였다(Kosugi et al. 1990). 담배의 경우 전신발현을 확인하기 위해서 기내에서 선발한 형질전환체의 잎 일부를 채취하여 GUS용액에 침지하여 GUS발현을 확인한 개체를 대상으로 T₁종자를 확보하였다. 확보한 종자는 소독 후 kanamycin 포함 배지에서 발아시켜 개체 전체를 GUS용액에 침지하였다. 국화는 기내에서 선발한 형질전환체의 잎 일부를 GUS용액에 침지하여 발현을 확인하였고 선발한 형질전환체를 증식 후 정식하여 개화 이후까지 GUS발현을 확인하였다. 국화에서 GUS활성분석은 국화 잎, 줄기, 꽃을 채취하여 Jefferson et al. (1987)의 방법에 따라서 각 기관별로 독립적인 4개의 시료로 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 UV5Nano (METTLER TOLEDO, Swiss)으로 단백질을 정량하였고 SYNERGY HTX (BioTek, USA)을 이용하여 비교하였다. 이때 사용한 대조구로는 동일한 국화에 35S-CaMV 프로모터에 GUS가 연결되어 있는 pCAMBIA2301 포함 국화 형질전환체를 이용하여 비교하였다. 측정한 수치들은 one-way ANOVA test (Moore et al. 2013)로 유의차를 분석하였고 독립변수는 각각의 line으로 종속변수는 GUS활성값으로 하였습니다. Turkey분석에 따라 각 기관별로 GUS활성 평균값이 큰 것부터 letters를 표기하였다.

프로모터 분리를 위한 전신발현 유전자 선발

국화에서 사용가능한 전신발현 프로모터분리를 위해서 국립농업과학원 유전체과에서 2배체 국화(Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino)로 분석한 전사체 분석결과를 분양받아 전신발현하는 유전자를 선발하였다(unpublished). 50개의 전신발현 후보 유전자를 선정하였고 각 유전자별로 기관에서의 발현조사를 위한 primer를 제작하여 RT-PCR을 수행한 결과 전 기관에서 발현하는 9개의 유전자를 선정하였다(Fig. 1, Supplementary Fig. 1 & Table 1).

프로모터 분리 및 조절인자 분석

전신발현을 확인한 9종의 유전자는 Genomewalking으로 프로모터의 영역을 분리하여 NetStart 1.0 (http://www. cbs.dtu.dk/services/NetStart/)에서 TSS (Transcription Start Site)를 추정하였고 유전자의 시작코돈(ATG)를 일부 포함한 UTR (5’-Un Translated Region)부분의 1~1.5 kb부분을 분리하여 GUS와 연결한 벡터를 각각 제작하였다. 선발 유전자 9종의 프로모터 영역을 분리하여 제작한 벡터로 담배에 형질전환을 수행한 결과 4종의 프로모터만이 GUS염색으로 발현을 확인할 수 있었다. 담배에서 발현을 확인한 4개의 유전자는 U33 (CONSTANS interacting protein 2b), U39 (esterase/lipase/thioesterase family protein), U41 (ethylene-responsive transcription factor 1-like), U47 (gibberellin 2-oxidase)였다. 이 중에서 gibberellin 2-oxidase의 프로모터(U47, 1060 bp)는 국화에서도 발현을 확인할 수 있었지만 나머지는 국화에서 GUS 염색을 확인할 수 없었다(data not shown). 그래서 나머지 3개 유전자의 5’-UTR (upstream region)을 추가로 분리하기 위한 geneome walking을 재수행하였다. 그 결과 U39의 경우는 적절한 프라이머 영역을 찾을 수 없어 추가 분리가 어려웠고 U33의 경우 약 3 kb의 5’-UTR영역을 분리하여 동일한 실험을 수행했지만 국화 및 담배에서 GUS발현을 확인할 수 없었다(data not shown). U41의 경우는 총 2060 bp의 프로모터 영역을 분리할 수 있었고 동일하게 담배와 국화에 다시 형질전환하여 GUS염색을 통한 발현을 확인할 수 있었다. GUS발현으로 프로모터로서 기능을 확인한 U41 (MN067811)과 U47 (MN067810) 프로모터는 NCBI에 등록하였고 나머지 선발 유전자의 프로모터 염기서열은 참고로 제시하였다(Supplementary Table 2).

국화와 담배에 동시에 발현한 U41과 U47 유전자의 프로모터 염기서열을 이용하여 PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)를 통해 조절 인자를 분석하였다.

U41은 ethylene-responsive transcription factor 1-like 유전자의 프로모터로 이와 관련한 다수의 호르몬 조절 인자를 찾을 수 있었다(Fig. 2). PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A, WRKY71OS은 Gibberellin regulation에 영향을 주는 전사인자이고(Mena et al. 2002, Zhang et al. 2004), NTBBF1ARROLB와 CATATGGMSAUR은 auxin regulation에 상호작용하는 전사인자로 알려져 있다(Baumann et al. 1999, Xu et al. 1997). 또한 CPBCSPOR (cytokinin)과 LTRECOREATCOR15 (ABA)도 유사하게 호르몬 관련 전사인자로 확인되었다(Fusada et al. 2005, Jiang et al. 1996). ERELEE4은 ERE (ethylene responsive element) motifs로 U3 promoter region의 ethylene에 의해 유기되는 활성을 조절하며(Rawat et al. 2005), WBOXNTERF3는 담배에서 전사억제인자인 ERF3의 프로모터를 조절한다(Nishiuchi et al. 2004). 특히 CACGTG인자는 GCC box를 통해 방어기작을 조절하는것으로 알려져 있다(Chakravarthy et al. 2003).

Fig. 2. Nucleotide sequence of the U41 (CmERF) promoter region. The start codon of CmERF is shown in capital letters (M). The cis-acting elements of the isolated promoter region were searched in PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements). Computer-derived putative cis-elements are shown in boxes.

U47은 gibberellin 2-oxidase 유전자의 프로모터 영역으로 Gibberellin생합성에 관련하는 유전자로 널리 알려져 있고 U41과 유사하게 호르몬 관련 인자들이 확인되었다(Fig. 3). PRIMIDINEBOXHVEPB1은 GA induction에 필요한 인자이며(Cercos et al. 1999), WRKY71OS은 gibberellin signaling pathway의 전사억제인자로 알려져 있다(Zhang et al. 2004). ASF1MOTIFCAMV은 두 개의 프로모터 모두에서 확인되는 인자로 다수 프로모터에서 나타나고 auxin에 의한 전사활성에 관여하는 인자이다(Klinedinst et al. 2000). MYB2CONSENSUSAT, ACGTATERD1는 dehydration-responsive유전자의 조절에 관련되어 있다(Simpson et al. 2003). 두 프로모터 모두 단백질합성이 시작되는 ATG앞에 프로모터발현을 시작하는 CAATBOX와 TATABOX를 확인하였다.

Fig. 3. Nucleotide sequence of the U47 (CmGA2 oxidase) promoter region. The start codon of CmGA2 oxidase 2 is shown in capital letters (M). The cis-acting elements of the isolated promoter region were searched in PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements). Computer-derived putative cis-elements are shown in boxes.

담배와 국화에서의 GUS발현 조사

9종의 프로모터를 분리하여 담배와 국화에 형질전환을 수행하였지만 최종적으로 2종의 프로모터만이 담배 및 국화에서 GUS발현을 확인할 수 있었다. 담배의 경우 GUS의 전신발현을 확인하기 위해서 T₀에서 선발한 형질전환체에서 T₁종자를 받은 다음 항생제 배지에서 선발하여 같은 라인에서 세 개체씩 염색하여 관찰하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Histochemical assays of GUS gene expression in transgenic tobacco seedlings (T₁). Tobacco plants transformed with U47 (A, CmGA2 ox::uidA) and U41 (B, CmERF:::uidA). C, non-transgenic plants.

U41의 경우 식물체 전체적으로 GUS시그널이 선명하여 선발한 라인 모두에서 프로모터가 잘 작동함을 확인할 수 있었다. U47의 경우에도 선발한 라인에서 모든 개체가 강한 GUS시그널을 보였다. 두 개의 프로모터를 비교했을 때 상대적으로 U41이 U47보다 전반적으로 약하게 염색되는 라인을 관찰할 수 있었다(Fig. 4B; T-209, 34).

국화의 경우 형질전환체를 선발한 다음 증식 후 포장에 심어 개화시킨 후 조직별로 시료를 채취하여 염색한 다음 관찰하였다(Fig. 5). 국화에서 상대적으로 발현이 약하다고 알려진 35S-CaMV 프로모터와 비교하기 위해서 pCAMBIA2301도 동일 품종 국화에 동시에 형질전환하여 비교하였다. 실험결과 잎에서는 U47프로모터의 형질전환체 12번 라인만 잎에서 약한 GUS시그널을 확인할 수 있었다(Fig. 5C). 꽃 조직은 다른 조직에 비해 선명한 시그널을 확인할 수 있었는데 pCAMBIA2301포함 형질전환체에서도 조금 더 뚜렷한 시그널을 보였다. 특히 U47 프로모터의 꽃은 세 개 라인 모두 선명한 시그널을 확인할 수 있었고 U41프로모터도 U47보다는 약하지만 4개라인 모두에서 시그널을 관찰할 수 있었다. 줄기 조직을 염색한 경우 U47 형질전환체 라인은 12번, 22번, 14번에서 모두 뚜렷한 시그널을 볼 수 있었고 U41의 경우 약하기는 하지만 네 개의 모든 라인의 줄기조직에서 염색반응을 관찰할 수 있었다(Figs. 5C, 5D).

Fig. 5. Histochemical analysis of GUS gene expression in transgenic chrysanthemum. A: non-transgenic plant, B, pCAMBIA2301 vector introduced plant, C: U47 (CmGA2 ox::uidA) promoter transformed chrysanthemums, D; U41 (CmERF:::uidA) promoter) transformed chrysanthemums. L : leaves, F: Flowers, S : stems. Scale bars, 1cm.

국화 형질전환체에서의 GUS활성 조사

2종의 프로모터를 형질전환한 국화의 잎과 꽃, 줄기 조직을 대상으로 GUS활성 조사를 수행하였다(Fig. 6). U47과 U41프로모터 형질전환체 전 라인을 통틀어 U47-12라인이 잎, 꽃 및 줄기조직에서 높은 GUS활성을 보여 전체 조직에서 고른 발현을 보였다. U47의 경우 상대적으로 잎이나 꽃보다는 줄기에서 pCAMBIA2301형질전환체 활성을 나타내었다. U41프로모터는 모든 라인이 잎 조직에서 35S-CaMV 프로모터와 유사한 활성을 보였고 꽃에서는 29번 라인의 경우 pCAMBIA2301형질전환체와 비슷한 활성을 보였지만 나머지 라인은 더 낮은 활성을 나타내었다. 상대적으로 줄기에서는 값의 차이는 있었지만 32번 라인을 제외하고 나머지 라인들은 35S-CaMV 프로모터보다 활성이 높은 경향을 보였다.

Fig. 6. Changes in GUS activity driven by U41 and U47 promoters in chrysanthemum. Average GUS activity (nmole MU/min/mg protein) of control, 35S-CaMV (pCAMNIA2301), U47, and U41 promoter constructs were performed in four single experiments with corresponding standard deviations. Statistical analysis of significant data was evaluated by one-way ANOVA (analysis of variance) test. Means with different lowercase letters were statistically different at p<0.05 between segments and between tissues, respectively.

전신발현 프로모터는 식물의 생장과 발달의 모든 단계에서 대부분의 조직과 세포에서 골고루 유전자발현을 조절하는 역할을 한다. 프로모터는 enhancers, silencers 등 조절인자를 포함하고 있는 core DNA sequence (core promoter)로 구성되어 있으며 이러한 조절인자들은 다양한 식물세포에서 유전자발현을 조절하기 위한 다수의 전사인자와 상호작용한다. 전신발현하는 프로모터를 이용해서 쌍자엽이나 단자엽에서 유의미한 결과를 얻는 경우가 많아서 높은 transgene발현이 필요한 유전자 검증에 사용할 수 있는 유력한 프로모터로 사용 가능하다(Dutt et al. 2014). 35S-CaMV 프로모터는 지금까지 식물에서 가장 광범위하게 사용하는 프로모터로서 대부분의 식물에서 높은 수준의 유전자발현을 유도한다. 35S-CaMV 프로모터가 대부분 전신발현을 유도하긴 하지만 식물의 발달상태나 환경적인 요인에 의해 발현이 달라지기도 하고 종특이적으로 유전자발현이 달라질 수 있다. 예를 들면 딸기에서는 35S-CaMV 프로모터가 화분에서 높은 발현을 보이지만 토마토나 페튜니아에서는 유전자발현을 확인할 수 없었다(Dutt et al. 2014, Hong et al. 2014). 특히 국화에서는 프로모터와 연결한 GUS유전자의 발현이 매우 약한 것을 확인한 바 있다(Dutt et al. 2014). 국화에서 BrSRS7유전자를 이용한 실험에서 동일한 유전자를 35S-CaMV 프로모터와 연결하여 형질전환한 경우 형질전환체 첫 세대에서는 초장감소의 표현형을 확인할 수 있었지만 월동 후 재정식하여 두번째 세대에서 유전자에 의한 표현형을 확인하기 어려운 경우를 확인한 바 있다(Suh et al. 2020).

국화에서 사용할 수 있는 전신발현 프로모터 개발을 위해 전 단계별 전사체 분석자료에서 50개의 전신발현 유전자중 전 기관발현이 확인된 9개의 유전자의 프로모터 영역을 분리하여 각각 담배와 국화에 형질전환하였다. 1차 분리한 프로모터로 형질전환했을 때 담배에서 4개의 프로모터만이 GUS발현을 보였고 국화에서는 U47프로모터만 GUS발현을 볼 수 있었다. U33 프로모터는 약 3 kb까지의 영역을 추가로 분리하여 동일한 실험을 수행했지만 담배와 국화에서 전혀 GUS발현을 볼 수 없는 반면 U47프로모터는 약 1 kb정도이지만 담배나 국화에서 충분한 시그널을 확인할 수 있었는데 이는 유전자발현을 잘 조절할 수 있는 프로모터는 길이가 아니라 영역에 어떤 cis-acting elements가 있는지가 더 중요하다는 사실을 보여주었다. U41의 경우 처음 분리한 프로모터(1312 bp)는 담배에서 GUS발현을 볼 수 있었지만 국화에서는 발현을 확인할 수 없었다. 추가로 분리한 총 2082 bp의 5’ UTR영역을 GUS와 연결하여 다시 국화에 형질전환 하였을 때 GUS 시그널을 확인할 수 있었다. 1312 bp이후의 프로모터 영역에서 정확히 어떤 cis acting element가 국화에서의 발현을 조절했는지는 알 수 없지만 추가로 분리한 영역에서 U41이 인지하는 ERF관련 motif가 국화에서 발현을 가능하게 했을 것으로 추정한다.

U41 프로모터는 ERF (ethylene response transcription factor)의 5’-UTR영역으로 biotic 혹은 abiotic stress에 반응하는 AP2/ERF family TF의 subfamily중 하나로 알려져 있다. 일반적으로 식물이 스트레스 상황에 처할 때 저항성을 유도하는데 관련되어 있고 대부분의 ERF가 transcriptional activators로 알려져 있지만 repressor의 역할도 한다고 알려져 있다(Thirugnanasambantham et al. 2015). 또 ERF TF는 ethylene inducible pathogenesis-related (PR genes) 과 DRE/CRT element의 프로모터에 있는 core GCCGCC sequence에 결합하여 발현을 조절하는 역할을 하고(Thirugnanasambantham et al. 2015) 에틸렌 생합성에 관련되어 있어 합성된 에틸렌이 에틸렌 ERF 발현을 활성화시킨다고도 알려져 있다. ERF subfamily는 애기장대에서 147개의 유전자가 보고될 정도로 가장 규모가 큰 family중 하나로 알려져 있으며 애기장대 게놈에서 2000개의 TF중 약 7%를 차지할 정도로 광범위하게 존재하는 유전자이다. 애기장대 외에 Vitis vinifera에서도 132개, wheat에서도 47개, soybean에서도 98개, 그리고 Populus trichocarpa에서도 169개의 ERF가 보고되었다(Nakano et al. 2006, Vogel et al. 2012). 다양한 작물에서 다수의 유전자로 존재하고 다양한 스트레스나 호르몬 발현에 관련되어 있기 때문에 국화에서도 ERF유전자의 5’-UTR영역이 전신발현 프로모터로 기능을 하는 것으로 생각한다.

U47 프로모터는 gibberellin 2-oxidase (GA2 ox)의 5’-UTR영역으로 phytohormone인 gibberellin (GA)의 합성에 관련되어 있다. GA는 식물의 생장 및 발달 즉 발아, 줄기신장, 잎의 발달, 꽃, 과실의 성숙 등 전반적인 할을 하는 중요한 호르몬이다. GA2 Oxidase는 GA20 ox, GA3 ox와 더불어 식물에서의 GA homeostasis와 환경 시그널에 반응하여 GA합성을 조절하는 주요 enzyme이다. GA20 ox, GA3 ox는 biosynthetic enzymes이지만 GA2 ox는 GA precursors 혹은 bioactive GAs를 2β-hydroxylation을 통해 inactive GAs로 바꾸는 GA deactivation enzymes으로 알려져 있다(Mena et al. 2002). GA2 ox는 종자식물에서 널리 분포되어 있는 유전자로 애기장대에서 9개, 벼에서 10개, Brachypodium distachyon에서 7개, Medicago truncatula에서 14개가 보고되었다(Hsieh et al. 2021). ERF와 마찬가지로 GA2 ox역시 다양한 기능을 하는 유전자 그룹에 속해 있기 때문에 유전자가 다발적으로 발현을 하고 그 유전자 발현을 조절하기 위해 5’-UTR영역의 프로모터도 전신발현으로 기능을 할 것을 추정한다. 실제로 국화에서 GA2 ox유전자를 분리하여 U47 프로모터와 연결하여 국화에 과발현을 유도했을때 선발단계에서 전혀 shoots가 발생하지 않았는데 동일 유전자를 국화 actin프로모터(Hong et al. 2016) 와 연결한 경우에는 형질전환체를 얻을 수가 있었다(data not shown). 이는 GA2 ox의 GA deactivation의 역할 뿐만 아니라 U47프로모터도 국화에서 작동하여 신초 재분화가 이루어 지지 않았을 것으로 추정한다.

국화 잎과 꽃 및 줄기를 이용한 GUS 염색은 잎의 경우 눈으로 GUS시그널을 찾는 게 어려울 정도로 약했다. 이는 GUS활성 측정 결과에서도 확인할 수 있었는데 U47의 12번 라인을 제외하고는 나머지 모든 라인의 잎에서 pCAMBIA2301형질전환체와 유사한 결과를 보였다. 꽃을 GUS염색한 경우에 U41-67이 제일 낮은 시그널을 보였는데 GUS활성 측정결과에서도 오차 범위내에 있기는 하나 67번 라인이 제일 평균 활성값이 낮았다. 줄기의 시그널은 U47의 세 라인 모두 pCAMBIA2301보다 GUS 염색 시그널이 진한데 실제 활성 측정 결과도 높게 나타났다. U41 프로모터의 경우에도 눈으로 확인한 염색 시그널은 약해 보였지만 32번라인을 제외한 다른 세 라인의 활성값은 pCAMBIA2301와 유사한 것을 알 수 있었다. 특히 U41프로모터의 경우 꽃 조직을 GUS염색했을 때 pCAMBIA2301에 비해 비교적 뚜렷한 시그널을 보였지만 GUS 활성 조사 결과는 29번 라인을 제외한 다른 라인의 값은 매우 낮게 측정되는 결과를 확인할 수 있었다. 전신발현 프로모터의 경우 동일 개체를 증식할 때 같은 조건에서 키워서 유사한 생육단계라고 생각되는 시기에 GUS염색을 해보면 개체간 염색차이를 보이는 현상이 발생하는데 조직을 GUS염색한 것과 실제 활성측정이 일치하지 않는 이유도 이와 유사하게 시료채취에 따른 편차때문으로 생각한다. 실제로 국화에서 발굴한 actin프로모터(Suh et al. 2016)도 동일 개체를 증식하여 키운 후 모든 개체를 GUS염색을 해보면 개체마다 약간씩 염색 정도나 부위가 달라지는 경향을 확인 할 수 있었다. 마찬가지로 pCAMBIA2301을 도입한 국화 형질전환체의 경우도 여러 번 그리고 여러 개체를 GUS염색해서 GUS시그널을 확인한 바 있다(data not shown). 줄기의 GUS활성은 조직 염색으로 봤을 때는 U47이 뚜렷한 발현을 보이고 상대적으로 U41프로모터가 약해보이지만 활성측정에서는 U47-22라인만 조금 높을 뿐 U47의 12번과 U41의 29번, 58번 라인이 오차 범위 안 차이를 보이지 않는 것으로 확인되는데 이러한 결과도 마찬가지로 시료채취에 따른 편차인 것으로 추정한다. 본 실험에서도 이 편차를 줄이기 위해 4개의 독립적인 개체를 가지고 실험하였는데 국화에서 프로모터의 발현을 측정할 때는 가능하면 독립적인 4개 이상의 개체를 사용하여 측정하는 것이 좀 더 확실한 결과를 얻는 방법이 될 것으로 생각한다. 일반적으로 상용화한 국화는 대부분 6배체로 아직 6배체 국화에 대한 유전체 정보가 없는 상태에서 국화의 프로모터를 분리하는 것은 결코 쉽지 않았다. 이전에 분리한 국화 actin프로모터처럼 보다 강력한 프로모터를 찾기 위해 β-tublin을 찾고자 했지만 여러 번의 시도에도 1 kb이상 연결된 염기서열을 확보할 수 없었다. 이는 multi copy로 존재하는 경우 국화에서는 더 많은 copy수로 존재하면서 특정 염기서열의 게놈을 연속적으로 분리하는 게 매우 어렵기 때문일 것이다. 본 실험에서 분리한 두 프로모터는 35S-CaMV보다 국화에서 안정적으로 작동하기 때문에 국화의 유전자 검증이나 국화에 개량이 필요한 요소의 형질전환에도 충분히 사용이 가능할 것으로 생각된다.

국화는 장미, 백합 다음으로 인기 있는 관상용 식물입니다. 일반적으로 쌍떡잎식물에 아직도 가장 널리 사용되고 있는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터는 매우 강력한 프로모터로 대부분의 작물에서 충분한 효과를 나타낸다. 그러나 Chrysanthemum에서는 약한 발현이 자주 보고되어 Chrysanthemum에서 이용 가능한 전신발현 프로모터를 찾았다. 국화의 전사체 분석 데이터를 바탕으로 구성적으로 발현되는 9개의 유전자를 선택하고 genome walking 을 통해 각 프로모터 영역(1.0-3.0 kb)을 분리했다. 9개 프로모터중 두 개만이 담배와 국화에서 GUS가 발현되었다. CmERF 프로모터(U41, 2060 bp)의 주요 모티프는 에틸렌(ERELEE4) 또는 지베렐린 조절(PYRIMIDINEBOXOSRAMY1, WRKY71OS)과 관련이 있었다. 마찬가지로, CmGA2 ox 프로모터(U47, 1060 bp)의 모티프에는 PRIMIDINEBOXHVEPB1 및 WRKY71OS와 같은 지베렐린 신호 인자가 존재했다. 담배에서는 두 프로모터가 모두 GUS 염색에서 매우 강한 전신 발현을 보였다. 국화에서는 담배에 비해 약하지만 꽃과 줄기에서 유의미한 발현이 확인되었다. 국화 형질전환체를 이용한 GUS 활성 분석 결과, U47 프로모터를 포함한 형질전환체(#12)가 35S-CaMV 프로모터보다 모든 조직에서 더 높은 발현을 나타내었다. U41 프로모터는 줄기에서 35S-CaMV 프로모터에 비해 상대적으로 높은 발현을 보이는 것으로 나타났다.

본문의 Supplementary Fig. 1과 Supplementary Tables 1-2는 한국육종학회지 홈페이지에서 확인할 수 있습니다.

본 연구는 농촌진흥청 어젠다 과제(과제번호 PJ 01570602)연구비에 의해 이루어진 것임