녹두(Vigna radiata L.)는 콩과의 한해살이풀로 줄기는 30~80 cm, 꼬투리는 5~6 cm, 꼬투리에 10~15개의 종실이 들어 있으며 발생지는 인도이며, 미얀마, 아프리카, 중동, 미국 등 광범위한 지역에서 재배되는 작물이다(Ahn et al. 2004, Hong et al. 2015, Kim et al. 2019a).

녹두 종자의 빛깔에 따라 노란색, 갈색, 검은 빛을 띤 갈색 녹두로 구분되며, 그 중 녹색 녹두가 전체의 90%를 차지하고 있다(Kim et al. 2013). 최근 40여년 동안 국내 녹두 재배면적 추이는 2010~2017년에 1,958 ha로 2000년대의 1,816 ha보다 약간 증가하여 일정한 수준을 유지하고 있으나, 1980년대 7,246 ha와 1990년대 3,806 ha에 비해 각각 27%, 51% 수준에 그친다고 알려져 있다(Kim et al. 2019b).

녹두는 당질 45~62%, 조단백질 20~28%, 조지방 1% 내외로 함유하고 있다. 녹두는 또한 높은 영양가를 지니고 있고, 많은 양의 식이 단백질, 필수 아미노산(leucine, lysine, valine, methionine, tryptophane, cystine 등), 식이섬유, 비타민 및 미네랄로 구성되어 있다(Kim et al. 2021, Lai et al. 2010, Song 1994). 그리고 플라보노이드(Vitexin과 Isovitexin 등), 페놀성 화합물, 다당류 및 향기 성분과 같은 여러 활성 물질이 녹두에서 나타나며 항당뇨, 항산화, 항염증, 항균 그리고 신경보호 특성을 가지고 있고, 해독, 열사병 완화, 부기 감소 능력으로 잘 알려져 있다(Jiang et al. 2020, Lee & Shibamoto 2000, Xu et al. 2021, Yao et al. 2008, Yao et al. 2013, Zhang et al. 2013).

일반적으로 새싹식물은 종자 발아 후 약 4~10일 된 싹을 말하며(Di Gioia et al. 2017), 성숙한 식물에 비해 아미노산, 무기질, 비타민, 식이섬유, 플라보노이드 등 영양성분과 생리활성물질이 4~100배 정도 더 많이 함유되어 있다고 알려져 있다(Kim & Lee 2010). 이러한 기능성 성분들은 영양학적 가치뿐만 아니라 만성질환 예방과 건강증진에 이점이 있어(Yu et al. 2020), 최근 새싹을 활용한 다양한 기능성 식품소재 개발 연구가 활발히 진행되고 있다(Jang et al. 2018, Lee et al. 2018, Park et al. 2015). 이에 녹두 종실의 기능성 물질에 대한 연구가 진행되고 있으나, 녹두순의 기능성 물질에 대한 연구는 매우 미미하며, 대사체 수준에서 식별 기술 개발에 대한 연구는 진행된 바가 없다. 대사체 연구는 주로 FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy), HNMR (proton nuclear magnetic resonance spectroscopy)및 MS (mass spectrometry)등의 분석 데이터를 이용하여 진행되고 있다. 특히, Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy 분석은 시료 간의 대사체 물질 차이를 판별하고 대사체 마커 개발에 활용되고 있다(Krishnan et al. 2005). FT-IR spectroscopy을 이용한 대사체학 연구는 amino acids (glutamic acids, Aspartic, Trytophan), proteins (α-Helix, Anti-parallel β-sheet), Lipids/fatty acids (υ (C-C)), monosaccharides (α, β-Glucose, β-Fructose) 등 시료 간의 양적, 질적 차이를 다변량통계분석을 이용한 대사체 정보 식별을 통해 구분할 수 있다(Gallardo-Velázquez et al. 2009, Schulz & Baranska 2007). 대사성분의 작용기작, 대사경로, 물질 탐색 등 기초학문을 활용하는 대사체학은 품종과 원산지 식별, 기능성 성분 함량 예측 등의 진위 식별, 표준화와 안전성에 관련한 식품과 의약품 산업에 다양하게 활용되고 있다. 대사체 분석을 통한 데이터 활용은 유용 생물학적 정보 추출을 위해 대표적으로 다변량통계분석기법 (PCA (Principal component analysis), PLS-DA (Partial least squares discriminant) 그리고 PLS (Partial least squares) regression 등)이 사용된다. 이러한 FT-IR 분석 기술과 다변량통계분석기법을 이용하여 미생물 유연관계 식별, 돌연변이 선발, 고등식물의 종 구분, 두과작물 품종 식별, 들깨 생산연도판별 등에 활용이 가능하다고 보고된 바 있다(Chen et al. 1998, Goodacre et al. 1998, Kim et al. 2004, Seo et al. 2024, Song et al. 2012, Stewart et al. 1997, Timmins et al. 1998, Wenning et al. 2002). FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 다변량통계 분석은 다양한 분야에 활용되고 있지만, 녹두 생육시기별 기능성 물질 변화에 대한 식별이 이뤄지고 있지 않다.

따라서 본 연구는 FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량통계분석 기법을 이용하여 녹두 생육시기별 기능성 물질 변화에 따른 신속한 구분 및 식별 체계를 확립하고 더 나아가 다양한 녹두 품종의 대사체 수준에서의 우수한 계통 선발을 위한 품종 식별 기술을 구축하고자 한다.

식물재료

본 연구에서 사용된 녹두는 국립식량과학원 작물기초기반과 작물유전체연구실에서 분양 받은 국내종(산포(SAP), 남평(NP), 어울(YU), 소현(SH), 문평(MP)) 5종을 사용하였다. 녹두는 백색광, 25℃, 40,000 lux 조건으로 설정된 growth chamber에서 재배하였으며, 파종 후 7일차, 10일차, 14일차, 17일차 녹두순을 수확하여 사용하였다. 수확된 시료는 세척 후 동결건조(Mareuda, MLU-9009)하였으며, 건조된 시료는 분쇄기(WONDER CRUSHER, (JP)WC-3L)로 분쇄하여 -20℃에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.

녹두순 whole-cell 추출물 제조

녹두순 분말 시료 20 mg에 20% (v/v) methanol 200 µL를 가하여 시료와 용매가 잘 섞이도록 vortexing 한 후, 50℃ water bath에서 30분 동안 5분 간격으로 vortexing하며 3회 반복 추출하였다. 추출된 시료는 원심분리(13,000 rpm, 15분)하고, 추출물 찌꺼기를 완전히 제거하기 위해 상층액만을 다시 한번 원심분리(13,000 rpm, 5분)하여 새로운 상층액만을 회수하였다. 회수된 추출물은 -20℃에서 냉동 보관하며 FT-IR 스펙트럼 분석에 사용하였다(Seo et al. 2024, Song et al. 2014).

FT-IR 스펙트럼과 데이터 전처리 및 다변량 통계분석

FT-IR (Fourier transform infrared) 스펙트럼 조사는 Tensor II (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany)과 DTGS (Deuterated triglycine sulfate) 검출기를 사용하였다(Seo et al. 2024, Song et al. 2014). 추출된 각각의 시료는 384-well ZnSe plate에 5 µL씩 분주하였으며, 각 시료의 FT-IR 스펙트럼은 5반복 측정하였다. 37℃ hot plate에서 약 20-30분간 건조하였으며, 건조된 ZnSe plate는 Tensor 27에 장착된 HTS-XT (Bruker Optics GmbH) 고효율 자동화 장치를 이용하여 스펙트럼을 측정하였다. 스펙트럼은 4000-400 cm^-1 범위에서 4 cm^-1 간격으로 128회 반복 측정된 평균 스펙트럼을 분석에 사용하였다. Bruker사의 OPUS Lab (ver. 7.0, Bruker Optics Inc.) 프로그램을 사용하여 FT-IR 스펙트럼을 조사하고 데이터 변환하였으며, FT-IR 스펙트럼 분석 영역의 양 끝점(800-1800 cm^-1)의 흡광도를 0으로 조정하여 baseline을 교정하였고, 각 스펙트럼을 동일 면적으로 normalization하여 실험상의 오차를 최소화하였다. 이후 데이터의 mean centering 과정을 거쳐 2차 미분을 수행한 다음 전처리가 완료된 스펙트럼 데이터를 다변량 통계분석을 위한 표준화된 데이터로 사용하였다(Seo et al. 2024, Song et al. 2014). 가공된 FT-IR 스펙트럼 데이터는 NIPALS 알고리즘(Wold 1966)을 이용하여 R 프로그램(version 3.1.2)에서 PCA (Principal component analysis)와 PLS-DA (Partial least squares discriminant)분석을 수행하였다(Fiehn et al. 2000, Trygg et al. 2007). Hierarchical dendrogram은 FT-IR 데이터의 PLS-DA로부터 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean analysis)를 R program (ver. 3.1.2)으로 분석하여 euclidean distance를 측정하고 각 시료의 유연관계를 나타냈다.

녹두순의 FT-IR 스펙트럼 비교 분석

FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 다변량 통계분석을 통해 녹두순의 생육시기에 따른 기능성 물질 함량의 유연관계를 분석하여 녹두순의 생육시기별 대사체 함량을 식별하고자 하였다. FT-IR 스펙트럼의 특정적인 주요 부위는 각각 특정 화합물들을 나타내는데, 주로 Amide I 과 II을 포함하는 1750-1500 cm^-1 사이의 영역은 P=O, C=O 신축 진동, N-H 굽힘 진동, C-C 그리고 C=C (아미노산 및 단백질 2차 구조의 변화)들의 질적, 양적 정보를 나타내고, 1500-1300 cm^-1 부위에서는 phosphodiester group을 포함한 CH3, CH2, CH 그룹의 C-H 굽힘 진동과 PO2-의 P=O (핵산 및 인지질) 비대칭 신축 진동의 정보를 나타내며, 1100-950 cm^-1 부위에서는 carbohydrates 계열의 C-O, C-C, C-O-C 그리고 C-O-P (단당류나 복합 다당류) 신축 진동 및 CH3, CH2 진동을 통한 화합물들의 질적, 양적 정보가 반영되어 나타난다(D’Souza et al. 2008, Dumas & Miller 2003, Lopez-Sanchez et al. 2010, Parker 1983, Wolkers et al. 2004, Yee et al. 2004). 생육시기에 따른 녹두순 시료들의 FT-IR 스펙트럼을 비교 분석한 결과 1750-1500, 1500-1300, 1150-950 cm^-1 상에서 특정적인 스펙트럼 패턴 변화를 나타내었다(Fig. 1A). 즉, 녹두순에 함유되어 있는 아미노산이나 및 단백질, 지방산, 그리고 탄수화물계통 화합물들은 FT-IR 스펙트럼 상에서 질적, 양적 차이가 대사체 수준에서 크게 이루어지고 있음을 알 수 있었다. 따라서 FT-IR 스펙트럼 분석은 주요 대사체의 질적, 양적 변화를 분석하여 생육시기에 따른 녹두순의 기능성 물질 변화를 판단하는 수단으로써 활용이 가능할 것이다.

Fig. 1. Multivariate analysis of FT-IR spectral data from mung bean sprout. (A) Representative FT-IR spectra of each line. (B) PCA score plot of FT-IR spectral data. (C) Loading values of PC 1 and PC 2. (D) PLSDA score plot of FT-IR spectral data. SAP: Sanpo, NP: Nampyeong, YU: Owool, SH: Sohyeon, MP: Munpyeong.

FT-IR 스펙트럼 다변량 통계분석 및 대사체 수준 유연 관계 비교

녹두순의 생육시기에 따른 FT-IR 스펙트럼 데이터를 PCA 분석한 결과(Fig. 1B), PC 1의 설명력은 81.2%, PC 2의 설명력은 7.0%로 나타났다. 또한 PC 1과 PC 2를 축으로 한 PCA score plot상에서 생육시기에 따른 녹두순 시료들의 분포를 보면 7일차가 좌측 하단에 위치하고 10, 14, 17일차가 전체적으로 나타으며 대사체 증가가 10일 이후에 큰 변화가 없는 것으로 판단된다(Fig. 1B). 각각의 산포, 남평, 어울, 소현 그리고 문평 품종을 PCA 분석한 결과 PC 1과 2의 설명력이 각각 39.7%와 33.2%, 82.6%와 14.2%, 88.3%와 9.6%, 91.9%와 6.0% 그리고 86.7%와 9.8%로 나타났다(Fig. 2). 5품종의 패턴 변화는 생육시기에 따라 7, 10. 14, 17일순으로 대사체 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 산포 품종의 경우 7일과 10일의 대사체 변화가 비슷한 패턴을 보이지만 14일과 17일는 확연히 다르게 나타났다(Fig. 2A). 하지만 남평, 어울, 소현 그리고 문평 품종은 7일차 이후로 10, 14, 17일 차이가 나타나면서 대사체 변화는 10일차 생육이 가장 많이 나타낸 것으로 판단된다(Figs. 2B, 2C, 2D, 2E). 이처럼 녹두순의 생육시기에 따른 대사체 함량 변화가 서로 다른 분포를 나타내면서 이의 대사체 변화를 확인할 수 있었다(Fig. 2). 현재까지 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 녹두순의 생육시기에 따른 대사체 함량 식별 분석이 없었지만, FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 보고에 따르면 두과작물의 품종간 대사체 식별(Song et al. 2012), 배추 계통 식별을 통한 F1 판별(Ahn et al. 2016), 아티초크의 품종간 대사체 식별(Kim et al. 2016), 들깨 품종의 원산지 판별(Yang et al. 2022), 들깨의 생산연도 간의 차이와 유의성 판별이 가능한 것으로 보고되었다(Seo et al. 2024). 따라서, 녹두순의 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 생육시기별 대사체 분석을 통해 생육시기에 나타날 수 있는 대사체의 차이와 변화를 확인할 수 있다. 이는 녹두순 기능성 소재개발 품종 육성에 빠르고 정확한 선택을 할 수 있을 것으로 기대된다.

Fig. 2. PCA score plot of FT-IR data from mung bean sprout. Dotted shapes represent significant FT-IR spectral region for metabolic discrimination from growth time. (A) Sanpo, (B) Nampyeong, (C) Owool, (D) Sohyeon, (E) Munpyeong.

녹두순의 FT-IR 스펙트럼 데이터 식별에 중요하게 작용한 FT-IR 스펙트럼 부위를 확인하였다(Fig. 1C). FT-IR loading value를 확인한 결과, PC 1과 2를 분류하는 기준은 1700-1500, 1500-1300 그리고 1100-950 cm^-1임을 알 수 있었다(Fig. 1C). FT-IR 스펙트럼(Fig. 1A)과 loading value (Fig. 1C) 상에서 차이를 나타냈던 부위가 일치하였고, 이 부위가 나타내는 아미노산 및 단백질 2차 구조의 변화, 핵산 및 인지질 그리고 carbohydrates 계열의 단당류나 복합 다당류 질적, 양적 차이가 나타남을 의미하며 녹두순 생육시기별 대사체 변화 식별에 중요한 역할을 하는 것으로 알 수 있었다(Schulz & Baranska 2007) (Fig. 1C).

PLS-DA 분석의 경우 PCA 분석 보다 생육시기에 따른 녹두순의 대사체 변화 식별이 뚜렷하게 나타났다(Fig. 1D). PLS-DA score plot을 보면 우측 상단에 7일차 녹두순이 위치하였고, 10, 14 그리고 17일차 녹두순이 그룹을 형성하여 나타났다(Fig. 1D). 이처럼 녹두순의 생육시기에 따라 대사체 변화가 각각 다르게 나타나면서 대사체 분석을 통한 생육시기 판별이 가능한 것으로 나타났다. 5품종 생육시기에 따른 녹두순의 대사체 변화를 확인하기 위해 PLS-DA 분석을 Fig. 3에 각각 나타내었다. 각각의 품종을 분석한 결과, 산포 품종은 7일차부터 17일차까지 생육시기에 따른 대사체 분포를 보면 각각의 생육시기별 패턴 변화가 뚜렷하게 나타났고(Fig. 3A), 남평과 어울 품종의 경우 10일차 이후 14일과 17일의 대사체 변화는 유사한 모습을 볼 수 있었다(Figs. 3B, 3C). 또한, 소현과 문평 품종은 7일와 10일에서 큰 변화를 보이지만, 14일과 17일에서는 유사한 변화를 나타냈다(Figs. 3D, 3E). 따라서 10일 이후 대사체는 더 이상 변화하지 않는 것으로 판단된다. 이상의 연구 결과는 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 녹두순 생육시기별 대사체 함량 식별이 가능함을 알 수 있었다.

Fig. 3. PLS-DA score plot of FT-IR data from mung bean sprout. Dotted shapes represent significant FT-IR spectral region for metabolic discrimination from growth time. (A) Sanpo, (B) Nampyeong, (C) Owool, (D) Sohyeon, (E) Munpyeong.

생육시기에 따른 녹두순의 대사체 함량 유연관계를 PLS-DA로부터 HCA dendrogram을 확인하였다(Fig. 4). 산포와 문평 품종은 생육 10, 14, 17일차에서 유사성을 나타내고 7일차는 상대적으로 독립성을 나타냈다(Figs. 4A, 4E). 남평과 소현 품종은 생육 7, 10일차에서 유사성을 나타내고 14, 17일차에서 7일차와 유사성을 나타냈다(Figs. 4B, 4D). 그리고 어울 품종에서는 7, 14, 17일차에서 유사성을 나타내고 10일차는 독립성을 나타냈다(Fig. 4C). 따라서 생육시기에 따른 대사체 함량 변화는 생육 10일차가 지나면서 대사체 함량 변화가 일어나지 않음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 HCA dendrogram에서 각각 품종의 생육시기별로 대사체 함량을 식별할 수 있음을 알 수 있었다. 이처럼 FT-IR 스펙트럼 데이터를 활용한 대사체 분석은 스펙트럼의 특정 부위 따라 녹두순에서도 중요하게 작용하여 생육시기에 따른 대사체 식별에 관여하고 생육시기를 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.

Fig. 4. HCA dendrograms from PLS-DA of FT-IR data from mung bean sprout. Capitals and numbers represent sample names and their replicates, respectively. (A) Sanpo, (B) Nampyeong, (C) Owool, (D) Sohyeon, (E) Munpyeong.

따라서 본 연구에서 확립된 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 녹두순의 생육시기에 따른 대사체 함량 판별 기술은 품종의 신속한 선발 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대되며 우수한 계통을 선발하여 육종을 통한 품종 생산성 증대에 기여 할 수 있을 것으로 예상된다.

본 연구는 FT-IR 스펙트럼 데이터를 활용하여 녹두순의 생육시기별 대사체 함량 변화를 분석하고 신속하고 정확하게 구분할 수 있는 체계를 확립하였다. FT-IR 스펙트럼의 특정 영역(1700-1500 cm^-1, 1500-1300 cm^-1, 1100-950 cm^-1)은 아미노산, 단백질, 핵산, 지질, 당 등 주요 대사체의 질적 및 양적 변화를 반영하였으며, 이는 생육시기별 대사체 변화를 판단하는 데 중요한 역할을 하였다. PCA 분석 결과, 생육시기에 따라 대사체 군집이 명확히 구분되었으며, 특히 7일차와 10일, 14일, 17일차 간의 대사체 변화가 뚜렷하게 구분되었다. 이는 생육시기별 대사체 변화가 큰 차이를 보임을 의미한다. PLS-DA 분석에서도 유사한 결과를 확인할 수 있었으며, 생육시기별 대사체 변화가 명확히 구분되어, 생육시기 판별에 유용한 정보를 제공하였다. 이러한 기술은 녹두 품종 선발 및 육종 과정에서 중요한 도구로 활용될 수 있으며, 기능성 소재 개발에도 기여할 수 있다. 또한 녹두의 생산성 증대와 기능성 물질 연구에 중요한 기여를 할 것으로 기대된다.

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(과제번호:PJ017380012024)의 지원에 의해 수행하였습니다.