적요
Mung bean (Vigna radiata) is a rich natural source of vitexin and isovitexin—flavonoids known for their potential anti-inflammatory properties. The aim of this study was to evaluate, through the use of RAW 264.7 macrophages, the anti-inflammatory effects of extracts from mung bean seeds containing vitexin and isovitexin. High-performance liquid chromatography (HPLC) was employed to quantify the levels of these compounds in various mung bean cultivars: “Jinhwang,” “Samhwang,” “Seonhwa,” and “Jangan,” as well as “Dahyeon,” and “Sanpo,” two of the most widely cultivated varieties in Korea. Cytotoxicity assays revealed no significant toxicity at concentrations of 25, 50, and 100 µg/mL, allowing further analysis at these levels. In nitric oxide (NO) inhibition assays, “Samhwang” (10.61 µM) and “Seonhwa” (9.7 µM) demonstrated the highest NO-suppressing activity at 50 µg/mL. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) levels were significantly reduced by “Seonhwa” (83.6 pg/mL) and “Jangan” (72.3 pg/mL), with “Jangan” showing the strongest inhibitory effect. Interleukin-6 (IL-6) analysis revealed notable suppression in “Samhwang,” “Seonhwa,” and “Jangan” at 50 µg/mL, with “Samhwang” exhibiting the most potent effect (78.6 pg/mL). These findings suggest that the “Samhwang” cultivar, in particular, possesses significant anti-inflammatory potential and may serve as a valuable candidate for the development of natural anti-inflammatory agents.
서언
녹두(
Phaseolus aureus L.)는 아열대성 기후에서 생육되는 콩과작물로 인도, 미얀마, 스리랑카 등 아시아 지역이 원산지이며(
Lee et al. 2019), 국내에서는 다협 다수성인 다현 녹두(
Kim et al. 2009a), 중대립 다수성인 산포 녹두(
Kim et al. 2017), 노란 종피 결각엽인 삼황 녹두(
Kim et al. 2020) 등 다양한 품종이 재배되고 있다. 녹두는 탄수화물 45-62%, 단백질 20-28%, 지방함량은 1%로 전분함량이 높고(
Kim et al. 2013), 아미노산, 플라보노이드, 페놀성 화합물 등의 다양한 생리활성 물질이 다량 함유되어 있는 것으로 보고되었다(
Kim et al. 2021,
Lai et al. 2010,
Lee et al. 2016).
Flavonoid는 식물의 이차대사산물로서 현재까지 약 8,000종 이상이 보고되어 있으며(
Harborne & Williams 2000), heterocyclic 구조에 따라 플라본(flavones), 플라보놀(flavonols), 플라바논(flavanone), 플라바놀(flavanol) 또는 카테킨(catechin), 안토시아닌(anthocyanin) 및 칼콘(chalcone)으로 구성되어있다(
Panche et al. 2016). 플라보노이드는 지질의 산화, 활성산소 제거 및 산화적 스트레스를 막는 역할을 함으로서 노화를 예방하거나 지연하는 효과가 있다고 보고되었으며(
Kim et al. 2014), 특히 Rice-Evans (
Rice-Evans et al. 1996) 등의 연구 결과에 의하면 플라보노이드는 사람에서 강력한 항산화 효과를 나타내며, 인체 자체적으로 합성되지 않기 때문에 식이를 통해 섭취해야한다는 결과가 보고되었다.
염증 반응은 외부의 자극이나 신체 내부로 유입되는 박테리아 또는 세균감염 등에 대한 비특이적 면역 반응 중 하나로 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2), inflammatory cytokine 등 다양한 염증성 매개 물질의 분비를 촉진시킨다(
Kim et al. 2021). 대식세포(macrophage)는 염증 반응에 관여하는 대표적인 세포로 lipopolysaccharide (LPS)의 자극을 받게 되면 염증성 매개물질인 interleukin (IL)-6, nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 등의 pro-inflammatory cytokine과 nitric oxide synthase (NOS), cyclooxygenase (COX) 등의 염증 반응 인자들을 활성화하여 분비를 촉진시킨다(
Jeong et al. 2012,
Lee et al. 2004). 염증 매개 물질 중 NO는 특히 높은 반응성을 가진 물질로, 정상적인 NO는 세균을 죽이거나 종양을 제거하는 항균 및 항암 효과를 가지지만, 외부 요인에 의해 과도한 NO의 생성은 염증을 유발시켜 신경손상, 조직 손상 및 유전자 변이를 일으켜 염증성 질환을 악화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(
Stuehr et al. 1991). 이러한 염증 유도 인자들의 작용으로 인해 면역세포들이 활발하게 반응하며 염증성 반응이 촉진되고(
Ialenti et al. 1992), 반응이 지속되거나 과도하게 일어날 경우, 만성 염증성 질환으로 진행될 수 있기 때문에 이를 조절할 수 있는 천연 유래 항염증 소재의 개발이 중요하다. 최근 다양한 식물 유래 자원이 항염증 효능을 지닌 것으로 보고되고 있으며, 그중 녹두(
Phaseolus aureus L.)는 전통적으로 해독, 해열, 소염 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 플라보노이드, 폴리페놀 등의 생리활성 성분을 풍부하게 함유하고 있어 항염증 효과가 기대되는 식물 자원이다.
녹두의 주요 성분 중 하나인 Vitexin은 apigenin-8-C-glucoside에 속하는 플라보노이드 화합물로 다양한 약용식물에서 발견되었으며(
Gaitan et al. 1989), 항산화, 항염증, 항암, 항경련, 항불안 등의 생리활성 효능을 가진다(
Kalinova et al. 2021). Vitexin의 이성질체인 Isovitexin은 apigenin-6-C-glucoside에 속하며 Vitexin과 유사한 화학구조를 가지며 항산화 및 항염증 등의 효과를 포함한 다양한 약리학적 활성을 나타낸다(
Zhang et al. 2011). Vitexin은 녹두 종피에 다량 함유되어 있어 LPS로 자극한 RAW 264.7 대식세포에서 NF-kB 경로를 저해하고, TAK1 인산화와 IkBα 분해를 억제해 p65의 전위를 감소시켜 iNOS/COX-S 발현과 NO, TNF-α, IL-6 생성을 낮춘다(
Sae tan et al. 2020). 녹두의 기능성에 관한 연구로는 팥과 녹두의 이소플라본 함량과 항산화 및 혈전용해 활성(
Oh et al. 2003), 녹두 에탄올 추출물 및 분획물이 피부의 미백, 항염증 효과에 미치는 영향(
Lee et al. 2018), 녹두추출물의 자극 완화 효과에 관한 임상 연구(
Ahn et al. 2004) 등의 연구가 진행되었지만, 국내에서 재배된 녹두 품종 별 기능성 물질인 vitexin과 isovitexin의 함량에 대한 분석과 국내 재배 녹두 품종을 이용한 항염증 억제 실험에 관한 연구는 부족한 상황이다.
따라서 본 연구는 국내 재배 녹두 품종을 대상으로 녹두 종자가 함유하고 있는 기능성 물질인 vitexin과 isovitexin의 함량을 분석하고, LPS로 자극한 RAW264.7 세포에 녹두 추출물을 처리하여 NO 생성 억제, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6) 생성 억제에 미치는 영향을 확인하고, 더 나아가 녹두를 이용한 항염증 소재로서 활용 가치가 높은 품종을 탐색하여, 천연 항염증 소재 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.
재료 및 방법
식물재료
본 실험에 사용된 녹두는 국립식량과학원 작물기초기반과 작물유전체 연구실에서 분양 받은 녹두로 외래종 1종(인도)과 국내종 19종(남평, 금성, 어울, 삼강, 소선, 소현, 다선, 다현, 주현, 수현, 산포, 문평, 아름, 진황, 다도, 삼황, 선화, 경선, 장안) 20품종을 이용하여 실험에 사용하였다.
주요 성분 추출 및 분석 조건
품종별 녹두 종자의 주요 성분인 vitexin과 isovitexin의 함량을 분석하기 위해 분쇄한 녹두 종자 15 mg에 발효주정(덕산과학, Korea, 프레타놀 A, 95%) 30% (V/V) 300 μL를 추출 용매로 사용하여 1시간 진탕하였다. 원심분리한 상층액을 0.22 μm 필터 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 사용한 HPLC는 Thermo Fisher Vanquish core를 이용하였고, UV-vis 검출기를 이용하여 337 nm 파장으로 Vitexin과 Isovitexin을 검출하였다. 유속은 0.3 mL/min이고, 분석 시간은 30분으로 설정하였다. 분석 시간별 용매 조건은
Table 1과 같이 설정하였다. Vitexin과 Isovitexin 각각의 검량선을 조제하여 함량을 정량하였다.
녹두 종자를 품종별로 분말화한 20품종 중 6품종(다현, 산포, 진황, 삼황, 선화, 장안 녹두)의 항염증 활성평가를 위한 추출물 제조방법은 분말화한 시료 100 g에 30% 발효 주정 2 L를 첨가 후 회전식 진탕기(Dasol Scientific cp., LTD, Flask Shaker, DS-300L)로 상온에서 24시간동안 진탕 추출하였다. 추출 후 Whatman No.2 필터로 여과하여 회전식감압농축기(EYELA, NVC-2100)를 사용하여 농축 후 고형분을 Dimethyl Sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, 99.5%)를 이용하여 100 mg/mL의 농도로 재용해 하여 활성 평가 분석을 하는데 사용하였다.
세포 배양 조건
RAW 264.7 cell은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 세포 배양액은 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco), 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco), 1% Penicillin-Streptomycin (P/S, Gibco)이 함유된 배지를 사용하여 37℃, CO2 5% 조건의 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 5×105 cell 개수를 맞춰 계대배양을 진행하였다.
세포 독성 평가
녹두의 vitexin과 isovitexin이 세포 독성에 미치는 영향을 측정하기 위해 WST assay를 이용하였다. RAW 264.7 세포(1×104)를 10% FBS가 첨가된 세포 배양용 배지를 이용하여 96-well plate에 100 μL 분주한 후 24시간 동안 CO2 배양기에 배양하였다. 녹두 추출물 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL농도를 1% penicillin-streptomycin (P/S)만 함유된 배지에 혼합하여 분주하였고, 24시간동안 배양기에 배양하였다. EZ-Cytox Cell viability Assay Kit (DoGenBio Co., Ltd. Seoul, Korea)를 10 μL씩 주입 후 배양기에서 빛을 차단 하여 반응시켰다. 3시간 동안 반응 후 microplate reader (Thermo Fisher, Varioskan Flash, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도 측정하였으며, 세포 생존율은 다음과 같이 계산하였다.
Nitric Oxide (NO) 생성 억제 활성 측정
RAW 264.7 세포(5×05)를 10% FBS가 첨가된 세포 배양용 배지를 이용하여 24 well-plate에 1000 μL 분주한 후 24시간 동안 배양기에 배양하였다. 배지를 제거하고 LPS (Gibco, USA) 1 μg/mL과 농도별로 조제된 추출물을 함유한 배지를 동시에 처리하여 24시간동안 배양하였다. 24시간 후 새로운 96 well-plate에 배양 배지 상등액 100 μL을 넣은 뒤 Nitric oxide pluse Detection kit (Intron Co., Korea)에 동봉된 N1 buffer와 N2 buffer를 각각 10분간 실온에서 반응 시킨 후 520 nm에서 흡광도 측정을 하였다. 표준곡선은 Nitrite (FW: 69.0, standard, 2 Mm)를 이용하여 6 serial 2-fold dilution하여 얻었으며, R2값은 0.1 이상이었다.
염증성 cytokines (TNF-α, IL-6) 생성 억제 측정
RAW 264.7 세포(5×105)를 10% FBS가 첨가된 세포 배양용 배지를 이용하여 24 well-plate에 분주한 후 24시간 동안 배양기에 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 LPS (Gibco, USA) 1 μg/mL과 농도별로 조제된 추출물을 함유한 배지를 동시에 처리하여 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양 후 얻어진 상등액의 cytokine 함량을 측정하였다. 모든 시료는 냉동보관(-20℃)하였다. 염증성 cytokine은 ELISA kit (mouse enzyme-linked immunosorbent assay kit, R&D Systems Inc.)를 이용하여 제시된 Protocol에 따라 수행하였으며, 표준곡선의 R2값은 0.99 이상이었다.
통계처리
모든 실험은 3회 반복 측정하여 얻은 결과로, 유의성 검사는 GraphPad Prism version 9.0.0 (121)을 이용하여 대조군(다현, 산포)과 실험군(진황, 삼황, 선화, 장안)을 두 개의 student t-test로 분석하였으며, 대조군과 비교하였을 때 p<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
결과 및 고찰
녹두 20품종 Vitexin 및 Isovitexin 함량 분석
녹두 20품종을 30%주정으로 추출하여 HPLC로 Vitexin과 Isovitexin의 함량을 분석한 결과는 품종에 따른 차이가 존재함을 확인 할 수 있었다(
Table 2). Vitexin과 Isovitexin의 함량을 비교했을 때, 진황, 삼황, 선화, 장안 품종에서 함량이 높은 것으로 나타났다. 또한, Isovitexin의 함량에 비해서 Vitexin의 함량이 약 1.5배 이상 높은 것으로 나타났다.
본 연구에서 분석한 Vitexin 및 Isovitexin 함량을 기존 연구와 비교했을 때, Kim 등(
Kim et al. 2009b)의 결과에서는 vitexin 평균 함량 8.7~10.2 mg/g, isovitexin 9.5~10.6 mg/g으로 본 실험의 결과와 비교하였을 때 약 8배 이상 높은 수치를 나타냈다. 또한, 녹두의 다양한 부위 중 종피에서 Vitexin과 Isovitexin이 검출되었는데, 이는 식물체 부위에서 특정 성분이 분포할 가능성을 제시한다. 하지만, 본 연구에서는 녹두 종자 전체를 분석하였으므로, 기존에 보고된 연구와 비교하는데 한계가 있을 것으로 생각된다. 이러한 함량 차이는 품종뿐만 아니라 연차, 온도 등 재배 환경 조건에 따라 플라보노이드 함량의 변이가 큰 것으로 알려져 있다(
Kitamura et al. 1991). 기능성 식품 개발 및 항염증 연구를 위해 HPLC를 이용해 함량 분석을 진행한 결과로 세포 실험에 사용할 녹두 종자는 가장 재배가 많이 되고 있는 품종인 다현, 산포 녹두와 본 실험의 결과에서 vitexin과 isovitexin 함량이 가장 높은 진황, 삼황, 선화, 장안 녹두로 선별하였고, 이들 품종은 기능성 식품의 천연 항산화 및 항염증제 개발에 활용이 가능할 것으로 보인다.
녹두 추출물이 RAW 264.7 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 WST assay를 실시한 결과는
Fig. 1과 같다. 24시간 동안 25, 50, 100 μg/mL의 농도의 추출물을 세포에 처리하여 대조군과 처리군을 비교하였을 때, 대조군인 다현 녹두와 산포 녹두, 처리군인 삼황 녹두는 모든 농도에서 세포 생존율이 대조군과 유사하게 나타났다(
Figs. 1A,
1B,
1D). 진황 녹두와 장안 녹두에서는 50 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 유의하게 감소하였지만, 25, 100 μg/mL 농도에서는 대조군과 비슷하거나 더 높은 경향을 보였다(
Figs. 1C,
1F). 선화 녹두는 25 μg/mL 농도에서 유의하게 감소하였으나 농도가 높아질수록 25 μg/mL 농도의 생존율보다 증가하는 경향을 보였다(
Fig. 1E). 이상의 결과로 녹두의 품종별 추출물이 RAW 264.7 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보았으며, 80.7% ~ 149.2%의 높은 생존율을 나타내 6품종(다현, 산포, 진황, 삼황, 선화, 장안)에서 세포 독성이 관찰되지 않았다.
선행연구에 따르면, Wi 등(
Wi et al. 2012)은 vitexin을 이용하여 25, 50, 100 μM 농도를 3T3-L1 세포에 처리하였을 때 독성이 나타나지 않았다고 보고하였으며, Lv 등(
Lv et al. 2016)의 연구에서는 isovitexin을 농도를 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 200 μg/mL 농도에서 세포독성이 나타났다고 발표하였다. 본 연구 결과에서는 Vitexin 및 Isovitexin이 함유된 녹두 추출물을 동일한 세포주인 RAW 264.7 세포에 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 결과, 모든 품종에서 평균 생존율은 80.7-149.2% 범위이며 진황 녹두, 장안 녹두 50 μg/mL에서 유의한 저하를 제외하면 농도 의존적 세포 독성은 관찰되지 않았다. 이는 선행연구와 유사한 처리조건에서도 독성이 나타나지 않았다는 점에서, 본 실험에 사용된 녹두 추출물의 세포 독성이 매우 낮다는 것으로 보인다. 따라서, 본 연구에서는 25, 50, 100 μg/mL의 농도를 기반으로 항염증 활성을 평가하였다.
본 연구에서는 품종 별 녹두 추출물의 항염증 활성을 확인하기 위해 RAW264.7 대식세포를 대상으로 LPS에 의해 유도된 Nitric Oxide (NO) 생성량을 측정한 결과는
Fig. 2에 제시하였다. LPS를 첨가하지 않은 무처리군에서는 7.08 μM의 함량이 나타난 반면, LPS를 처리한 군에서는 30 μM로 약 4배 이상의 NO 생성이 관찰되어, 염증반응이 유도된 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 조건에서 녹두 추출물을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 결과 품종에 따라 서로 다른 NO 생성 억제 효과를 나타냈다. 다현 녹두는 LPS 처리군인 양성대조군과 추출물 처리군을 비교하였을 때 각 농도별로 21.7 μM, 21.3 μM, 21.7 μM로 LPS 단독 처리군에 비해 농도가 감소한 것을 확인할 수 있었다(
Fig. 2A). 산포 녹두는 14.7 μM, 15.4 μM, 14.9 μM로 다현 녹두에 비해 NO 생성량이 효과적으로 감소하는 경향을 보였다(
Fig. 2B). 진황 녹두는 각 농도 별 28.91 μM, 28.48 μM, 28.52 μM으로 LPS 처리군과 유사한 값을 나타냈고(
Fig. 2C), 장안 녹두는 19.65 μM, 18.35 μM, 18.95 μM로 LPS 처리 군과 비교하였을 때 유의적으로 감소하는 경향을 보였다(
Fig. 2F). 삼황 녹두와 선화 녹두는 50 μg/mL 농도에서 각각 10.61 μM과 9.7 μM로 다른 추출물에 비해 가장 우수한 NO 소거능을 보여주었다(
Figs. 2D,
2E).
이러한 결과는 선행연구들과 비교했을 때 유사한 경향을 보였다. Rosa 등(
Rosa et al. 2016)의 연구에서 Vitexin이 LPS로 자극시킨 마우스의 복강 내에서 NO 분비를 감소시키고 염증성 매개체의 전사인자를 조절하여 LPS에 의해 활성화된 p-p38, p-ERK1/2, p-JNK 등의 발현을 저해하는 효과를 보였다고 밝혔다. 또한 Lin 등(
Lin et al. 2005)의 연구에서 Isovitexin이 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 억제 IC
50값이 58.5 µM로 NO 생성 억제시킴을 보고하며 이는 iNOS 프로모터 및 NF-κB 전사 활성을 억제함으로써 NO 생성을 감소시킨 결과라고 설명하였다. 이처럼 Vitexin과 Isovitexin은 항염증 활성을 유도하는 주요 플라보노이드로 알려져있으며, 본 연구에 사용된 녹두 추출물 또한 이러한 성분들을 함유하고 있기 때문에 NO 생성을 효과적으로 감소시킴을 알 수 있었다.
Nitric Oxide는 면역 반응에서 중요한 매개체로 외부물질에 대한 방어 작용을 하는 신호 전달 물질이다. iNOS (nitric oxide synthase)에 의해 L-arginine이 L-citruline으로 변화되는 과정에서 생성되며 대부분의 조직세포에 영향을 미쳐 긍정적인 측면으로는 혈관 이완 물질, 신경 전달 물질로, 면역 방어 물질로 알려져 있으나(
Ryu & Kim 2006), iNOS가 과도하게 생성될 경우 세포 손상 및 염증 반응을 일으키고, 알츠하이머와 파키슨 병과 같은 퇴행성 질환을 유발하게 된다(
Thomsen et al. 1994).
본 연구 결과에서 나타난 바와 같이 일부 녹두 품종, 특히 삼황 녹두와 선화 녹두는 NO 생성을 효과적으로 억제하는 활성을 나타냈으며, 이는 iNOS 경로를 차단하거나 염증 유도 신호 전달을 저해함으로써 발생한 결과로 해석할 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 녹두 추출물은 과도한 NO 생성을 억제하여 염증 반응을 조절할 수 있는 천연 항염증 소재로 활용 가능성이 높은 것으로 나타냈다.
RAW 264.7 세포에서 염증성 Cytokines (TNF-α, IL-6) 활성 소거능
품종별 녹두 추출물을 이용하여 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 농도 별로 처리하여 cytokines (TNF-α, IL-6)의 생성 억제 효과를 측정한 결과는
Figs. 3, 4에 제시하였다. RAW 264.7 세포에 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군에서는 염증 반응이 유도되지 않았지만, LPS만을 처리한 양성 대조군에서 TNF-α와 IL-6 생성량은 각각 310.1 pg/mL, 639.5 pg/mL로 cytokines가 발현되어 염증반응이 유도되었음을 확인할 수 있다. Bak 등(
Bak et al. 2013)의 결과에서 LPS로 Raw 264.7 세포를 자극하여 염증반응을 유도하였을 때, IL-6와 TNF-α의 생성량이 증가하였다는 선행 연구 결과와 일치하다는 것을 알 수 있다.
녹두 추출물을 농도 별로 처리하였을 때, TNF-α에서 양성대조군에 비해 확연히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(
Fig. 3). 대조군인 다현 녹두와 산포 녹두를 농도별로 처리하여 비교하였을 때, 다현 녹두에서는 175.2 pg/mL, 177.6 pg/mL, 174.8 pg/mL 값을 보여주었고, 산포 녹두는 124.7 pg/mL, 98.8 pg/mL, 84.9 pg/mL으로 다현 녹두 품종에 비해 산포 녹두 100 μg/mL 농도에서 TNF-α소거 능력이 우수하다고 판단된다(
Figs. 3A,
3B). 처리군의 결과를 비교했을 때, 진황 녹두에서는 각각 241.8 pg/mL, 234.8 pg/mL, 226.0 pg/mL의 소거능력을 보여주었고, 삼황 녹두에서는 123 pg/mL, 106.5 pg/mL, 103.9 pg/mL의 값을, 선화 녹두는 99.40 pg/mL, 83.6 pg/mL, 90 pg/mL으로, 장안 녹두에서는 78.17 pg/mL, 72.34 pg/mL, 76.71 pg/mL의 소거활성을 나타냈으며(
Figs. 3C,
3D,
3E,
3F), 선화 녹두와 장안 녹두 품종에서 가장 우수한 소거능을 보여주었다. 특히 장안 녹두 50 μg/mL (
Fig. 3F) 농도에서 72.34 pg/mL로 다른 품종의 추출물에 비해 우수한 TNF-α 활성 소거능을 보여주었다.
IL-6 실험의 결과로는, 녹두 추출물을 농도별 25, 50, 100 μg/mL 처리하였을 때, TNF-α의 결과와 마찬가지로 LPS 처리군에 비해 추출물 처리군에서 IL-6 생성량이 확연히 감소하는 것을 보여주었다(
Fig. 4). 대조군인 다현 녹두에서는 579.0 pg/mL, 570.5 pg/mL, 567.2 pg/mL의 소거능을 보여주었고, 산포 녹두에서는 139.5 pg/mL, 138 pg/mL, 126.6 pg/mL의 소거능을 보여주어 TNF-α와 마찬가지로 산포 녹두에서 우수한 소거능을 보여주었다(
Figs. 4A,
4B). 추출물 처리군에서는 진황 녹두가 각각 354.9 pg/mL, 333.5 pg/mL, 326.4 pg/mL의 값을 나타내었고, 삼황 녹두는 102.5 pg/mL, 78.6 pg/mL, 83.15 pg/mL으로 우수한 소거능력을 보여주었다. 선화 녹두는 112.7 pg/mL, 101.6 pg/mL, 102.8 pg/mL로, 장안 녹두는 125.4 pg/mL, 118.5 pg/mL, 122.4 pg/mL의 소거능을 나타냈다. 따라서 대조군에 비해 IL-6 소거능이 우수한 품종은 삼황 녹두, 선화 녹두, 장안 녹두 품종이라는 결과를 도출할 수 있었다(
Figs. 4C,
4D,
4E,
4F). 특히 삼황 녹두 50 μg/mL 농도에서 IL-6 소거 능력은 78.6 pg/mL로 다른 품종의 추출물 처리군에 비해 가장 높은 IL-6 억제 능력을 나타냈다.
활성화된 대식세포는 IL-1β, TNF-α, IL-6 등의 여러 가지 cytokine을 생산함으로써 이후의 면역반응을 유도한다고 알려져 있다. 그중 TNF-α는 미성숙 수지상세포의 표면에 단백질 혹은 보조자극인자의 발현을 촉진하여 성숙된 형태의 수지상세포로 전환시켜 T림프구와 상호 작용하여 T림프구의 활성과 성장 등을 조절하며 암세포의 세포 용해를 유도함으로써 직접적으로 항암 작용을 나타내기도 한다(
Yoon 2008). IL-6는 조혈작용과 면역반응을 조절하는데 관여하는 다양한 기능을 가진 cytokine으로서 B세포의 항체생성 세포인 plasma cell의 최종 분화를 유도하는 활성을 가진 B세포 자극 인자로 면역글로불린의 합성을 증진하고, 다른 cytokine과 협동하여 상승작용을 나타내는 등 다양한 작용을 한다(
Cha et al. 2010). He 등(
He et al. 2016)의 연구 결과에 따르면 LPS로 자극시킨 RAW 264.7 세포에 Isovitexin을 처리하였을 때, TNF-α의 발현을 억제했다고 보고하였고, Kang 등(
Kang et al. 2015)의 결과에서는, Vitexin을 이용하여 지방세포인 3T3-L1 세포를 이용하여 염증 유발을 하였을 때 IL-6 발현이 억제된다고 보고하였다. 이러한 선행 연구 결과로 녹두 추출물은 LPS로 생성된 염증 매개 물질들을 억제시킴으로써 항염증 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 천연 소재로써 염증 억제 관련 소재를 개발하는데 도움이 될 것으로 보인다.
이와 같은 결과를 종합하면, 녹두 주정 추출물은 염증 반응 매개 물질인 NO와 Cytokines (TNF-α, IL-6)를 억제시키는 효과를 지니고 있으며 특히 삼황 녹두와 선화 녹두 품종이 50 μg/mL 농도에서 NO 억제가 두드러지게 나타났고, 장안 녹두는 50 μg/mL 농도에서 TNF-α, 삼황 녹두는 IL-6 억제에서 우수하였다. 따라서 이들 품종은 천연물 유래 항염증 기능성 원료로의 우선 선발 후보로 제시되며, 결과의 일반화를 위해 in vivo 검증이 필요하다.
적요
본 연구는 품종 별 녹두 추출물에서 Vitexin과 Isovitexin의 함량을 측정하고, 6품종(다현, 산포, 진황, 삼황, 선화, 장안) 녹두를 선별하여 각 추출물이 RAW 264.7 마우스 유래 대식세포에서 나타내는 항염증 활성을 평가하기 위해 수행되었다. 먼저, HPLC를 이용하여 모든 품종에서 Vitexin과 Isovitexin의 함량을 분석하였을 때 진황, 삼황, 선화, 장안 녹두 품종에서 가장 높은 함량을 보였다. 따라서 우리나라에서 가장 많이 재배되고 있는 산포, 다현 녹두와 함량이 가장 많은 진황, 삼황, 선화, 장안 녹두 품종을 이용하여 항염증 실험을 진행하였다. WST assay를 통해 각 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과, 25, 50, 100 μg/mL 농도의 모든 품종에서 80% 이상의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 없음을 확인하였다. 이어서 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에서 NO (nitric oxide) 생성량을 측정한 결과, 삼황과 선화 품종이 50 μg/mL 농도에서 각각 10.61 μM과 9.7 μM로 NO 생성을 가장 효과적으로 억제하였으며, 이는 대조군 대비 약 65% 감소한 수치였다. 또한 cytokines (TNF-α, IL-6) 연구 결과 50 μg/mL 농도에서 TNF-α는 장안 녹두가 72.34 pg/mL, IL-6는 삼황 녹두가 78.6 pg/mL로 우수하게 억제하였다. 이러한 결과는 vitexin, isovitexin 등의 항염증성 플라보노이드 성분의 작용과 유사한 양상으로 해석되며, 삼황 녹두 품종이 천연물 유래 항염증 소재로서 가장 높은 활용 가능성을 가진 품종임을 확인하였다. 본 연구는 녹두 유래 천연 추출물을 이용한 항염증 기능성 소재로 개발하기 위한 기초자료로 제공하였으며, in vivo 검증, 신호 전달 기전 규명, 안전성 평가를 통해 천연 항염 소재로의 개발 가능성을 고도화 한다.
사사
본 논문은 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ01738001)의 지원에 의해 수행하였습니다.
Fig. 1Effects of MBE-30 extracts on cell viability RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (1×104) in 96-well plate treated (control, 25, 50, 100 μg/mL) with Mung Bean Extracts 30% for 24 hours. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. A; Dahyun, B; Sanpo, C; Jinhwang, D; Samhwang, E; Sunhwa, F; Jangan.
Fig. 2Effects of MBE-30 extracts on NO production of LPS-treated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (5×105) in 24-well plate treated (25, 50, 100 μg/mL) with Mung Bean Extracts30% and LPS (1 μg/mL) for 24 hours. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. A; Dahyun, B; Sanpo, C; Jinhwang, D; Samhwang, E; Sunhwa, F; Jangan.
Fig. 3Effects of MBE-30 extracts on TNF-αof LPS-treated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (5×105) in 24-well plate treated (25, 50, 100 μg/mL) with Mung Bean Extracts30% and LPS (1 μg/mL) for 24 hours. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. A; Dahyun, B; Sanpo, C; Jinhwang, D; Samhwang, E; Sunhwa, F; Jangan.
Fig. 4Effects of MBE-30 extracts on IL-6 of LPS-treated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (5×105) in 24-well plate treated (25, 50, 100 μg/mL) with Mung Bean Extracts30% and LPS (1 μg/mL) for 24 hours. All values were expressed as the average of triplicate samples with SD. A; Dahyun, B; Sanpo, C; Jinhwang, D; Samhwang, E; Sunhwa, F; Jangan.
Table 1
Table 1
|
Injection volume |
1 μL |
|
HPLC system |
Thermo Fisher vanquish core HPLC |
|
Column |
Acclaim™ RSLC PolarAdvantage2 C18 (2.1×150 mm, 2.2 μm, 120 Å) |
|
Oven temperature |
35℃ |
|
Detector |
UV-vis, 337 nm |
|
Flow rate |
0.3 mL/min |
|
|
Time (min) |
0.1% Acetic acid in water |
(B) 0.1% Acetic Acid in ACN |
|
|
0-2 |
98 |
2 |
|
2-5 |
70 |
30 |
|
5-20 |
65 |
35 |
|
20-23 |
10 |
90 |
|
23-27 |
98 |
2 |
|
27-30 |
98 |
2 |
Table 2The concentrations of Vitexin and Isovitexin in 20 types of mung bean varieties. Control group (Dahyun, Sanpo), Treated group (Jinhwang, Samhwang, Sunhwa, Jangan).
Table 2
|
Sample Name |
Vitexin (mg/g) |
Isovitexin (mg/g) |
Combined (mg/g) |
|
India |
0.87 |
0.64 |
1.51 |
|
Jinhwang* |
2.78 |
2.74 |
5.52 |
|
Sunhwa* |
2.69 |
2.45 |
5.14 |
|
Samhwang* |
2.45 |
2.33 |
4.78 |
|
Jangan* |
2.33 |
2.3 |
4.63 |
|
Dado |
1.83 |
1.77 |
3.6 |
|
Kyungsun |
1.52 |
1.51 |
3.03 |
|
Sohyun |
1.45 |
0.71 |
2.16 |
|
Soohyun |
1.34 |
0.74 |
2.08 |
|
Nampyeong |
1.21 |
0.8 |
2.01 |
|
Dahyun* |
1.25 |
0.66 |
1.91 |
|
Juhyun |
1.19 |
0.65 |
1.84 |
|
Moonpyeong |
1.21 |
0.63 |
1.84 |
|
Areum |
1.16 |
0.67 |
1.83 |
|
Eowool |
1.17 |
0.64 |
1.81 |
|
Sanpo* |
1.11 |
0.6 |
1.71 |
|
Sosun |
1.06 |
0.6 |
1.66 |
|
Kumseong |
0.96 |
0.62 |
1.58 |
|
Dasun |
0.76 |
0.44 |
1.2 |
|
Samkang |
0.67 |
0.45 |
1.12 |
References
- 1. Ahn GW, Kang TW, Jeong JH, Jo BK. 2004. Clinical studies on the anti-irritation effects of mung bean (Phaseolus aureus) extract in cosmetics. Journal of the Society of Cosmetic Scientists of Korea 30: 23-28.
- 2. Bak MJ, Truong VL, Kang HS, Jun M, Jeong WS. 2013. Anti-inflammatory effect of procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-induced RAW 264.7 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity doi:10.1155/2013/409321.
- 3. Cha JH, Kim YS, Lee EM. 2010. Effects of prunellae spica water extract on immune response in macrophage cells. J Orien Obstet Gynecol 23: 91-100.
- 4. Gaitan E, Lindsay RH, Reichert RD, Ingbar SH, Cooksey RC, Legan J, Meydrech EF, Hill J, Kubota K. 1989. Antithyroid and goitrogenic effects of millet: Role of C-glycosylflavones. J Clin Endocrinol Metab 68: 707-714.
- 5. Harborne JB, Williams CA. 2000. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55: 481-504.
- 6. He M, Min JW, Kong WL, He XH, Li JX, Peng BW. 2016. A review on the pharmacological effects of vitexin and isovitexin. Fitoterapia 115: 74-85.
- 7. Ialenti A, Ianaro A, Moncada S, Rosa MD. 1992. Modulation of acute inflammation by endogenous nitric oxide. Eur J Pharmacol 211: 177-182.
- 8. Jeong JB, Hong SC, Jeong HJ, Koo JS. 2012. Anti-inflammatory effects of ethyl acetate fraction from Cnidium officinale Makino on LPS-stimulated RAW 264.7 and THP-1 cells. Korean J Plant Res 25: 299-307.
- 9. Kalinova J, Vrchotova N, Triska J. 2021. Vitexin and isovitexin levels in sprouts of selected plants. Journal of Food Composition and Analysis 100: 103895. doi:10.1016/j.jfca.2021.103895.
- 10. Kang I, Choi S, Ha TJ, Choi M, Wi HR, Lee BW, Lee M. 2015. Effects of mung bean (Vigna radiata L.) ethanol extracts decrease proinflammatory cytokine-induced lipogenesis in the KK-Ay diabese mouse model. J Med Food 18: 841-849.
- 11. Kim BC, Lim IS, Jeon SY, Kang MS, Ha JM. 2021. Effects of irrigation conditions on development of mungbean (Vigna radiata L.) sprouts. Plant Breed Biotech 9: 310-317.
- 12. Kim DK, Choi JG, Lee YS, Son DM, Moon JK, Oh YJ, Kim KH. 2009a. A new mungbean cultivar, "Dahyeon" with many pod and high yielding. Korean J Breed Sci 41: 36-39.
- 13. Kim DK, Choi JK, Kim YS, Son DM, Seo MJ, Kim HT, Han WY. 2017. Mungbean cultivar, 'Sanpo' with medium-large grain and high yielding. Korean J Breed Sci 49: 113-117.
- 14. Kim DK, Choi JS, Kim SG, Lee KD, Seo MJ, Kang BK. 2020. A new mungbean cultivar, 'Samhwang', with yellow seed coat and lobed leaflets. Korean J Breed Sci 52: 179-183.
- 15. Kim DK, Son DM, Chon SU, Lee KD, Rim YS. 2009b. Variation of vitexin and isovitexin contents in mungbean (Vigna radiata (L.) wilczek) germplasms. Korean Journal of Plant Resources 22: 128-135.
- 16. Kim JW, Moon JS, Choe TB. 2014. Comparison of antioxidant activity of kenaf extract and its flavonoids. Korean Journal of Aesthetics and Cosmetology 12: 203-210.
- 17. Kim MY, Lee SH, Jang GY, Kim HY, Woo KS, Hwang IG, Lee JS, Jeong HS. 2013. Effects of heat treatment on antioxidant activity of hydrolyzed mung beans. Korean J Food Sci Technol 45: 34-39.
- 18. Kitamura K, Ijta K, Kikuchi A, Kudou S, Okubo K. 1991. Low isoflavone content in some early maturing cultivars, so called "summer-type soybeans". Japan J Breed 41: 651-654.
- 19. Lai F, Wen Q, Li L, Wu H, Li X. 2010. Antioxidant activities of water-soluble polysaccharide extracted from mung bean (Vigna radiata L.) hull with ultrasonic assisted treatment. Carbohy Polym 81: 323-329.
- 20. Lee KJ, Lee JR, Ma KH, Cho YH, Lee GA, Chung JW. 2016. Anthocyanin and isoflavone contents in Korean black soybean landraces and their antioxidant activities. Plant Breed Biotech 4: 441-452.
- 21. Lee KM, Kang BS, Lee HL, Son SJ, Hwang SH, Kim DS. 2004. Spinal NF-κB activation induces COX-2 upregulation and contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Eur J Neurosci 19: 3375-3381.
- 22. Lee YG, Bark SW, Kim HS. 2019. Physicochemical properties of the mung bean (Phaseolus aureus L.) as biohealth functional substance. The Korean Oil Chemists'. Society 36: 1096-1107.
- 23. Lee YL, Choi JH, Park SY, Jeong MY, Lee HC, Song JH. 2018. The influences of phaseolus radiatus L.'s ethanol extracts and fractions on skin whitening and anti-inflammatory effects. The Journal of Korean Oriental Ophthalmology & Otorhinolaryngology & Dermatology 31: 39-49.
- 24. Lin CM, Huang ST, Liang YC, Lin MS, Shih CM, Chang YC, Chen TY, Chen CT. 2005. Isovitexin suppresses lipopolysaccharide-mediated inducible nitric oxide synthase through inhibition of NF-kappa B in mouse macrophages. Planta medica 71: 748-753.
- 25. Lv H, Yu Z, Zheng Y, Wang L, Qin X, Cheng G, Ci X. 2016. Isovitexin Exerts Anti-Inflammatory and Anti-Oxidant Activities on Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury by Inhibiting MAPK and NF-κB and Activating HO-1/Nrf2 Pathways. Int J Biol Sci 12: 72-86.
- 26. Oh HS, Kim JH, Lee MH. 2003. Isoflavone content, antioxidative, and fibrinolytic activities of red bean and mung bean. Korean J Food Cook Sci 19: 263-270.
- 27. Panche AN, Diwan AD, Chandra SR. 2016. Flavonoids: An overview. J Nutr Sci 5: e47.
- 28. Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganga G. 1996. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 20: 933-56.
- 29. Rosa SI, Rios-Santos F, Balogun SO, Martins DT. 2016. Vitexin reduces neutrophil migration to inflammatory focus by down-regulating pro-inflammatory mediators via inhibition of p38, ERK1/2 and JNK pathway. Phytomedicine:. International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology 23: 9-17.
- 30. Ryu HS, Kim HS. 2006. Effect of zingiber officinale and hizikia fusiforme water extracts on NO production in macrophage of mice. Korean J Food & Nutr 19: 327-3.
- 31. Sae-tan S, Kumrungsee T, Yanaka N. 2020. Mungbean seed coat water extract inhibits inflammation in LPS-induced acute liver injury mice and LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages via the inhibition of TAK1/IκBα/NF-κB. J Food Sci Technol 57: 2659-2668.
- 32. Stuehr DJ, Cho HJ, Kwon NS, Weise MF, Nathan CF. 1991. Purification and characterization of the cytokine-induced macrophage nitric oxide synthase: An FAD- and FMN-containing flavoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 88: 7773-7777.
- 33. Thomsen LL, Lawton FG, Knowles RG, Beesley JE, Riveros-Moreno V, Moncada S. 1994. Nitric oxide synthase activity in human gynecological cancer. Cancer Res 54: 1352-1354.
- 34. Wi HR, Choi MJ, Choi SL, Kim AJ, Lee MS. 2012. Effects of vitexin from mung bean on 3T3-L1 adipocyte differentiation and regulation according to adipocytokine secretion. J Korean Soc Food Sci Nutr 41: 1079-1085.
- 35. Yoon TJ. 2008. Effect of water extracts from root of Tara-xacum officinale on innate and adaptive immune responses in mice. Korean J Food Nutr 21: 275-282.
- 36. Zhang J, Yuan K, Zhou WL, Zhou J, Yang P. 2011. Studies on the active components and antioxidant activities of the extracts of Mimosa pudica Linn. from southern China. Pharmacogn Mag 7: 35-39.
