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Korean. J. Breed. Sci. : Korean Journal of Breeding Science

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RAPD 마커를 �용한 한국밀� 유전� 다양성 �가 � 품종 �별

Assessment of Genetic Diversity and Identification of Korean Wheat Varieties using RAPD Markers

Korean Journal of Breeding Science 2017;49(2):65-71.
Published online: May 31, 2017

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*Corresponding author : (kcs1209@korea.kr, +82-63-238-5227)
• Received: March 14, 2017   • Accepted: April 20, 2017

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  • Eleven RAPD primers were assessed to analyze genetic diversity of Korean wheat varieties and to develop DNA marker for cultivar identification. The average of the number of polymorphic bands was 5.2 and PIC values showed 0.48, respectively. Ten major clades were presented by phylogenetic analysis. Three cultivars containing Uri, Hanbeak and Jonong were distinct from the others in the phylogenetic dendrogram. Seven cultivar-specific fragments were detected from 11 RAPD fingerprinting among 35 wheat cultivars and they were sequenced. Four Korean wheat cultivars, Eunpa, Jopoom, Yeonbaek and Jeokjoong, were identified newly by four markers, 84, 173, 174 and KWSM011. We convince that these new DNA markers are useful for cultivar fingerprinting and are applied to marker-assisted selection in wheat breeding program.
밀� 세계�으로 중요한 �량작물 중 하나로서 연간 600만톤 ��� �산�고 있으며 세계 �구� 40% ��� 밀� �량으로 �용하고 있고(Gupta et al. 2008), 한국�는 35개� 한국밀 품종� 개발�어 있다(Son et al. 2013). 밀� A, B, D 등 서로 다른 게놈� �함하는 6배체 �물�다. � 같� 특징으로 작물� 유전체 연구 모�로서 유용하기 때문� 세계�으로 밀� 연구가 활발히 진행�고 있고, 국내�서� 밀� 품질 � 품종특성 분� 등� 분�마커를 �용하고 한 연구가 진행�고 있다(Park et al. 2009).
�물 � �물� 기초 � �용 연구는 다양한 분�마커 (Molecular marker)� 개발� �해 눈� �게 발전�었다. 분� 마커는 작물� 유전� � 염색체 지� 작성 등� 유용하고, �용 �� 면�나 편�성, 경제성 등�서 매우 효과�으로 사용�고 있다. 작물� 유용형질 등과 연관� 유전� 특성� 환경� �향� 거� 받지 않기 때문� 유용형질과 관련� 분�마커를 �용한 간접�� 선발� 작물육종� 매우 효과��다(Kuchel et al. 2005). PCR법� 개발� 다양한 분�마커 기술개발� 촉진제가 �었으며, �물정보학(Bioinformatics)� 발달로 �해 분�마커 는 지금까지 유전� 지� 작성 � 진단, 형질전환체 분�, 게놈연 구, 종간 유연관계 � 계통분� 등� 유용하게 사용�고 있다 (Rafalski et al. 1993).
Randomly amplified polymorphic DNAs(RAPDs)는 �반 �으로 10 nucleotide� 짧고 무작위�� 프��머를 �용하여 PCR� 수행하는 방법으로 분�� 간단하고 �� 양� DNA가 있어� 분�� 가능하다(Williams et al. 1990). RAPD와 Denaturing gradient gel� 조합� �욱 세밀한 DNA 다형성 분�� 가능하게 하였고, 밀� 재배종 간� 특성 구별� 위해 사용�기� 하였다(He et al. 1992, Dweikat et al. 1994). �한 RAPD는 유전� 지� 작성, 유전� 분리, 재배종 구분, 집단 � 종간� 유전� 다양성 분�(Chalmers et al. 1992, Nesbitt et al. 1995), 종간 �는 �간� 계통학� 유연관계 분�(Landry et al. 1994) 등 여러 분야� 연구� �용 �었다. �와 같� 연구는 종특��(Chen et al. 1998), 게놈 특�� �는 염색체 특��(Wang et al. 1995) 마커 개발� 발전� ��었으며 특히 육종 과정 �안 분리� 집단�서 가능성 있는 유전�형� 확�하 고, 유용계통� 선발하기 위한 분�마커 개발 등� 사용�었다. RAPD 기법� �한 �물� 스트레스 관련 유전� �정� 위한 다형성 분�� �용�기� 하였다(Pakniyat & Tavakol 2007).
본 연구는 RAPD 분�법� �용하여 한국 밀 품종 간 다형성 분�� 통하여 다양성 분� � 품종 특�� 분�마커를 개발하기 위해 수행�었다.
Genomic DNA 추출
국내�서 육성� 35개 밀 품종� 종�를 페트리디쉬�서 발아 시켜 약 5 cm �기로 �란 어린잎� �용하였다. 채취한 잎� 액체질소� 급� �결하여 플�스틱 스틱으로 마쇄한 후 Genomic DNA extraction Kit for plant (SolGent, Korea)를 �용하여 제품� 추출 방법� 따� 수행하였다(Table 1). 추출� DNA는 nono drop� �용하여 �� 20 ng/ul� ��로 정량하여 사용하였다.
Table 1
35 Korean wheat cultivars used in this study.
Table 1
No Cultivar No Cultivar No Cultivar

1 Ol 13 Seodun 25 Baekjoong
2 Geuru 14 Saeol 26 Jeokjoong
3 Dahong 15 Jinpoom 27 Sugang
4 Chungkye 16 Milsung 28 Hanbaek
5 Eunpa 17 Joeun 29 Suan
6 Tapdong 18 Anbaek 30 Dajoong
7 Namhae 19 Jopoom 31 Goso
8 Uri 20 Shinmichal 32 Joah
9 Olgeuru 21 Jonong 33 Hojoong
10 Alchan 22 Jokyoung 34 Baekchal
11 Gobun 23 Yeonbaek 35 Jojoong
12 Keumkang 24 Sinmichal 1
RAPD 다형성 분�
RAPD 프��머는 �미 여러 연구�서 공개� 것 중�서 다형성� 보�는 것� 선발하여 사용하였다(Table 2). PCR� 전체 100 ng� DNA를 주형으로 하여, 프��머 0.5 μmol, dNTP 0.2 mM, Taq DNA polymerase 1 unit(GenetBio., Korea) � 조성으로 수행하였다. PCR 조건� denature; 94°C, 30초, annealing; 40°C, 30초, extension; 72°C, 1분으로 40회 반복하였 고, 1.5% 아가로스젤� 전기�� 한 후 다형성� 확�하였다. Polymorphism information content(PIC)는 PIC=1-∑i=1npi2a 으 로 계산하였다(Liu, 1998).
Table 2
Information of RAPD markers used in this study.
Table 2
Name Sequence(5'→3') Number of amplified bands PICz

84 GGGCGCGAGT 7 0.06
173 CAGGCGGCGT 6 0.10
174 AACGGGCAGC 6 0.99
B12 CCTTGACGCA 2 0.00
B18 CCACAGCAGT 5 0.74
OPG5 CTGAGACGGA 9 0.00
OPGQ1 GGGACGATGG 9 0.96
OPH20 GGGAGACATC 2 0.66
OPI01 ACCTGGACAC 4 0.74
UBC106 CGTCTGCGGG 5 0.92
RAPD14 CGTCTGCCCG 2 0.16

Mean 5.2 0.48

zPIC: Polymorphism information content

�로� � 염기서열 분�
전기���서 확�� 밴드 중 품종�서 특��으로 ��� 밴드(300 - 1,000 bp)는 agarose gel로부터 분리한 후 DNA fragment purification kit(Intron, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 정제� DNA 단편� pGEM-T vector(Promega, USA)� 결합한 후 competent cell(DH5α competent Escherichia coli cells)� 형질전환 시켜 배양하였다. 배양� 세�로부터 plasmid DNA를 다시 추출한 후 염기서열 분�� 수행하였다(Genotech, Korea). 염기서열� 유전� 정보 등� NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 웹사�트를 �용하여 분 �하였다.
유전� 유연관계 분�
RAPD 다형성 분�� 위해 밴드로 ��� 것� ‘1’, ���지 않� 것� ‘0’으로 코드화 한 후 NTSYS-pc 2.0 프로그램� �용하여 통계� 분�� 수행하였다(Rohlf 1998). 품종 간 연관 관계는 unweighted pair-group method on arithmetic averages(UPGMA)로 나타냈다.
분�마커 제작 � 품종 �용
품종 특��으로 발현� 밴드� 염기서열� �용하여 프��머 를 디��하기 위해 Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 프로그램� �용하였다. ��산물� 조건� 300 – 600bp, Tm (℃)� 55 – 60℃로 설정하여 프로그램� 실행하였다. 제작� 프��머는 DNA 마커로서 35개 국내 육성 밀 품종 �별 분�� �용�었다. 품종 �별� 위한 PCR 조건� denature; 94°C, 30초, annealing; 62°C, 30초, extension; 72°C, 1분으로 35회 반복하였으며, PCR 산물� 1.5% 아가로스젤�서 확�하였다.
RAPD 다형성 분�
다형성분�� 사용� PCR 산물� 100 - 1,000 bp 사��서 ��� 것으로서 밴드� 수와 �기를 분�하였다 (Table 2). 전체 57개� 밴드가 확��었고, 프��머 별 �균 5.2개, 최소 2개�서 최대 9개� 다형성 밴드가 나타났다. ��� 다형성 밴드는 84번 프��머�서 7개, 173번과 174번�서 6개, OPG5 와 OPGQ1�서 가장 많� 9개, B18과 UBC106�서 �� 5개, OPH20과 RAPD14�서 �� 2개� 다형성 밴드가 확��었다. PIC 값� �균 0.48로 나타났으며, ��� PIC 값� 84번 프�� 머는 0.06, 173번� 0.10, 174번� 0.99, B18� 0.74, OPGQ1� 0.96, OPH20� 0.66, OPI01� 0.74, UBC106� 0.92, RAPD14는 0.16�었고, B12와 OPG5는 �� 0.00으로 분�� 었다(Table 2). 브�질� 20개 밀 품종� 유전� 다양성 �가� 서 OPH20, OPI01, OPI05, OPG12, OPH01 등 5개� 다형성� 83%로 나타났다(De Freitis et al. 2000). �들 중 OPH20와 OPI01 등 2개 프��머는 한국밀 35개 품종�서� 74 - 90%(PIC 0.66 - 0.74)으로서 매우 높게 나타났다(Table 2). OPI01� ��� 밀 품종 분��서 377과 2,529 bp�서 7개� 다형성 밴드가 확��었지만, 한국밀 품종과 같� 뚜렷한 유전� 형� 나타나지 않았고, OPH20� 17개� 많� 다형성 밴드가 확��었고 품종 특�� 밴드가 647 bp와 403 bp�서 확��었 다(Grewal et al. 2007). 그러나 한국밀 품종 분��서 OPI01� 4개, OPH20� 2개� 다형성 밴드만 확��었다(Table 2, Fig. 1). � 같� 결과는 ��와 한국밀� 지역� 위치� 따른 유전� 다양성� 매우 �기 때문� 것으로 ���다. 한국밀 품종 분�� 사용� 11개 프��머� 다형성 밴드 수는 기존 보고� 것 보다 �었지만, 높� 다형성과 재현성� 나타냈기 때문� ��터 분� � 사용� 수 있었다(Table 2).
Fig. 1
RAPD analysis of 35 Korean wheat cultivars. Sizes of the amplified products range from 100 to 1,000 bp. The number and red arrows indicate Korean wheat cultivar-specific DNA fragments, respectively. The species specific DNA bands representing red arrows were eluted from agarose gel and sequenced. A; 84, B; 173, C; 174, D; OPGQ1, E; OPH20, and F; RAPD14. M; 1kb plus ladder.
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11개 RAPD 프��머 중 품종 특��으로 ���는 밴드가 뚜렷하게 나타나는 프��머는 84, 173, 174, OPGQ1, RAPD14, OPH20 등 6개였다. 다른 프��머�서 확�� 품종 특�� 밴드는 매우 �미하게 확��어 확실하게 구분할 수 없어 분��서 제외시켰다(Fig. 1). 84번 프��머를 �용하여 PCR 수행한 결과 우리를 제외한 34개 품종�서 3개� 밴드가 ���었다. 173번� 우리와 조� 등 2개 품종�서 2개� 밴드가 나타났고, 다른 품종들� 3개� 밴드가 나타났다. 174번� �파, 고분, 진품, 조� 등 4개 품종�서 320 bp� 밴드가 확��었다. OPGQ1는 4개� 주요 밴드 중 415 bp� 밴드는 금강, 조�, 조경, 연백, 백중, 조중, 백찰 등 7개 품종�서만 확��었다. OPH20� 탑�과 남해 등 2개 품종�서 800 bp와 650 bp� 밴드가 �� �미하게 나타났다. �들 6개� �균 PIC 값� 0.49였다(Table 2). RAPD14번� 32개 품종� 제외한 �파, 조품, 연백 등 3개 품종�서 316 bp � 밴드가 확��지 않았다 (Fig. 1). 분�� 통하여 품종 특�� 밴드를 나타내는 마커 중 174, OPGQ1, RAPD14 등 3개는 한국밀 품종 �별용 마커로 �접�으로 사용� 가능할 것으로 �단�다.
유전� 유연관계 분�
RAPD를 �용한 마커� 다형성 분�� 통해 확�� 밴드 중 100 - 1,000 bp 사�� DNA 밴드를 ��터화 하였다. 즉, PCR� 통해 ��� 밴드와 ���지 않� 밴드를 �� ‘1’과 ‘0’으로 ��터화하였다. 그 중�서 ��� 밴드� 확�� 불확 실한 것� ��터�서 제외시켰다. RAPD ��터를 사용하여 계통학� 분�결과 10개� 그룹� 확��었다(Fig. 2). 한국밀 품종 중 우리가 아웃그룹(⑩)으로 형성�었고 한백(⑨)과 조� (⑧)� 그 다� 그룹으로 �� 형성�었다. ① 그룹�서 올, 밀성, 다�, 올그루, 알찬, 신미찰 등 6개 품종� 확��었다. 올과 밀성� RAPD 다형성� 같았지만, 다른 4개 품종� 다형성 � �� 같� 것으로 확��었다. ② 그룹�서 7개� 품종� 함께 나타났으며, 청계, 탑�, 남해, 새올, 신미찰1호� 유전�형 � 같고 서둔과 호중� 유전�형� 같� 것으로 확��었다. ③ 그룹�서 5개� 품종� 확� �었으며, 수안과 다중, 조아와 백찰� 유전�형� �� 같� 것으로 나타났다. 금강, 조경, 백중, �중 등 4개� 품종� ④ 그룹�서 형성�었으며, 백중과 �중� 유전�형� 같게 나타났다. ⑤ 그룹� 고분, 진품, 조� 등 3개� 품종, ⑥ 그룹� 안백, 수강, 고소 등 3개 품종, ⑦ 그룹� �파, 조품, 연백 등 3개� 품종으로 �� 그룹화 �었다(Fig. 2). 본 연구� 사용� 품종� 모� 6배체 밀로서 품종 간 다양성� �게 나타나지는 않았지만, 조�, 한백, 우리는 다른 품종과� 유연관계가 먼 것으로 나타났다. 몇몇 RAPD 마커�서 RAPD-PCR� �한 재현성과 다형성� 확��었다. 그리고 RAPD는 빠르고 경제� ��� �기 때문� 밀� 육종�서 유용성� �다. 특히 많� 수� 유전�� �가� 유용하며 중요한 형질, 유전� �는 quantitative trait loci (QTL)와 연관마커 분�� 사용� 수 있다(Grewal et al. 2007).
Fig. 2
Dendrogram presenting genetic relationships among 35 Korean wheat cultivars. Ten association groups were formed.
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품종 특�� 프��머 디�� � �용
7개� 품종 특�� 단편� RAPD 프��머 분��서 확�� 었다(Table 3). �들 단편� 대한 유전� 정보를 분�하기 위해 NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)와 TIGR(http://blast.jcv i.org/er-blast/index.cgi?project=ath1) 등 ��터베�스를 활용 하였지만, 173번�서 분리� 단편� 제외한 나머지 DNA� 대한 기능� 알 수 없었다. 173번�서 분리� 278 bp �기� 단편� distachyon transcription factor 유전�� �부와 �치하 지만 유사�가 매우 낮게 나타났다 (Table 3). 6개 염기서열� �용하여 프��머를 디��하였고, 품종� �용한 결과 OPH20 � DNA 단편 염기서열�서 유래� 프��머 KWSM011(F: GGGAGACATCACCGGGCTGTACATG-3′, R: 5′-TCTTG CCCTCCAATACATAGTCC-3′)는 품종� �용했� 때, 500 bp와 600bp 등 2개� 구별 가능한 밴드가 확��었다(Fig. 3). 그러나 나머지 5개 프��머는 품종 간 차�를 나타내지 않아 품종 특�� 마커로서는 �합하지 않았다. 현재 한국밀 품종 �별용 마커는 Inter simple sequence repeat (ISSR)와 Amplific ation fragment length polymorphism(AFLP) 등� 분�� 통하 여 10개 세트가 개발�어 있다(Son et al. 2013, Son et al. 2014). �들 10개 마커 세트를 �용하여 품종 32개 중 27개를 구별할 수 있다. 본 연구�서 3개� RAPD 마커 � KWSM011 등 4개 마커는 새롭게 호중, 조중, 백찰 등 3개 품종� 추가� 35개 품종으로부터 개발� 것으로서 �들 마커 조합� �용하여 �파, 조품, 연백, �중 등 4개 품종� 구별할 수 있다. �들 4개 마커와 �미 개발� 11개 마커 세트를 �용하면 � 많� 품종� �별해낼 수 있지만, 3개 품종� 추가�었기 때문� 기존� 마커 조합과는 따로 사용하는 것� � 효율�� 것으로 ���다.
Table 3
Information of analyzed sequences of cultivar specific DNA fragments from the result of RAPD analysis.
Table 3
Primer name The length of analyzed sequences (bp) Predicted gene function sorted by NCBI E-value Query coverage (%)

173 278 Brachypodium distachyon transcription elongation factor 1 homolog (LOC100834870) 2e-15 34
173 319 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 2e-72 99
174 298 Triticum monococcum subsp. aegilopoides clone TbBAC30, complete sequence 4e-119 96
OPGQ1 415 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 6e-151 93
OPH20 575 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 1e-173 84
RAPD14 316 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 1e-62 93
Fig. 3
The profiles of PCR amplified DNA fragments using developed SCAR markers, KWSM011, in 35 Korean wheat cultivars. The number indicates Korean wheat cultivars. The arrows indicate differential amplified DNA fragments between cultivars.
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35개 한국밀 품종� 유전성 다양성과 품종 특�� 마커를 개발하기 위해 11개� RAPD 마커를 �가하였다. PCR 분� 결과 �균 5.2개� 다형성 밴드가 확��었으며, �균 PIC 값� 0.48�었다. 뚜렷한 품종특�� 밴드가 나타난 RAPD 프��머 는 84, 173, 174, OPGQ1, RAPD14, OPH20 등 6개였으며, � 중 OPGQ1, 174, RAPD14 등 3개는 품종 �별용 RAPD 마커로서 사용� 가능할 것으로 �단�었다. �한 OPH20�서 품종특�� 단편� �용하여 새로 디��� KWSM011는 품종 간 뚜렷하게 차�를 보�는 2개� 밴드가 확��어 품종 �별용 마커로서 �용할 수 있었다. OPGQ1, 174, RAPD14, KWSM011 등 4개� 마커를 �용하여 35개 품종 중 �파, 조품, 연백, �중 등 4개 품종� 구별할 수 있었다. 몇몇 품종 특�� DNA 단편� 유전� 정보는 RAPD173 프��머를 �용하여 ��� 278 bp� DNA 단편 �외는 대부분 정확한 유전� 기능 � 알려져 있지 않았다. 유전� 연관관계 분�� 통해 10개� 연관 그룹� 형성�는 것� 확�하였고, 한국밀 품종 중 우리, 한백, 조� 등 3개 품종� 다른 품종과� 다양성� � 것으로 나타났다.
본 연구는 2017년� �촌진�청 국립�량과학� 박사후연수 과정지�사업(PJ012464042017)� �해 �루어진 것임.
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Korean. J. Breed. Sci.. 2017;49(2):65-71.   Published online June 1, 2017
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Assessment of Genetic Diversity and Identification of Korean Wheat Varieties using RAPD Markers
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Fig. 1 RAPD analysis of 35 Korean wheat cultivars. Sizes of the amplified products range from 100 to 1,000 bp. The number and red arrows indicate Korean wheat cultivar-specific DNA fragments, respectively. The species specific DNA bands representing red arrows were eluted from agarose gel and sequenced. A; 84, B; 173, C; 174, D; OPGQ1, E; OPH20, and F; RAPD14. M; 1kb plus ladder.
Fig. 2 Dendrogram presenting genetic relationships among 35 Korean wheat cultivars. Ten association groups were formed.
Fig. 3 The profiles of PCR amplified DNA fragments using developed SCAR markers, KWSM011, in 35 Korean wheat cultivars. The number indicates Korean wheat cultivars. The arrows indicate differential amplified DNA fragments between cultivars.
Assessment of Genetic Diversity and Identification of Korean Wheat Varieties using RAPD Markers

35 Korean wheat cultivars used in this study.

No Cultivar No Cultivar No Cultivar

1 Ol 13 Seodun 25 Baekjoong
2 Geuru 14 Saeol 26 Jeokjoong
3 Dahong 15 Jinpoom 27 Sugang
4 Chungkye 16 Milsung 28 Hanbaek
5 Eunpa 17 Joeun 29 Suan
6 Tapdong 18 Anbaek 30 Dajoong
7 Namhae 19 Jopoom 31 Goso
8 Uri 20 Shinmichal 32 Joah
9 Olgeuru 21 Jonong 33 Hojoong
10 Alchan 22 Jokyoung 34 Baekchal
11 Gobun 23 Yeonbaek 35 Jojoong
12 Keumkang 24 Sinmichal 1

Information of RAPD markers used in this study.

Name Sequence(5'→3') Number of amplified bands PICz

84 GGGCGCGAGT 7 0.06
173 CAGGCGGCGT 6 0.10
174 AACGGGCAGC 6 0.99
B12 CCTTGACGCA 2 0.00
B18 CCACAGCAGT 5 0.74
OPG5 CTGAGACGGA 9 0.00
OPGQ1 GGGACGATGG 9 0.96
OPH20 GGGAGACATC 2 0.66
OPI01 ACCTGGACAC 4 0.74
UBC106 CGTCTGCGGG 5 0.92
RAPD14 CGTCTGCCCG 2 0.16

Mean 5.2 0.48

zPIC: Polymorphism information content

Information of analyzed sequences of cultivar specific DNA fragments from the result of RAPD analysis.

Primer name The length of analyzed sequences (bp) Predicted gene function sorted by NCBI E-value Query coverage (%)

173 278 Brachypodium distachyon transcription elongation factor 1 homolog (LOC100834870) 2e-15 34
173 319 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 2e-72 99
174 298 Triticum monococcum subsp. aegilopoides clone TbBAC30, complete sequence 4e-119 96
OPGQ1 415 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 6e-151 93
OPH20 575 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 1e-173 84
RAPD14 316 Unknown, Triticum aestivum chromosome 3B, genomic scaffold, cultivar Chinese Spring 1e-62 93
Table 1 35 Korean wheat cultivars used in this study.
Table 2 Information of RAPD markers used in this study.

PIC: Polymorphism information content

Table 3 Information of analyzed sequences of cultivar specific DNA fragments from the result of RAPD analysis.