적요
AbstractThe SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) gene encodes a MADS-box gene family of transcription factors that repress floral transition. To explore the function of the Brassica rapa SVP (BrSVP) gene during the flowering time of this species, a construct containing BrSVP under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter was introduced into B. rapa via Agrobacterium-mediated transformation. The resulting transgenic plants showed delayed flowering time, and RT-PCR analyses further revealed that BrSVP repressed the expression of the floral integrator genes AGL20, AGL24, and FT during vernalization. Our data indicated that BrSVP acts as a negative regulator in the flowering time of B. rapa and that it may therefore be a useful genetic source for crop improvement with respect to flowering time regulation.
서 언
배추는 우리나라 주요 3대 작물 중의 하나로 가장 넓은 면적에 재배되는 채소로 육종과 신품종 개발이 꾸준히 진행되고 있다. 배추가 개화를 하기 위해서는 일정기간 이상의 저온처리(vernalization)를 필요로 하며 서늘한 기후에서 재배하기 적합한 작물이다. 우리나라에서는 급작스런 온도 변화로 저온에 감응하여 일찍 추대 현상이 일어나면서 배추의 상품성을 크게 떨어뜨린다. 작물에서 추대 및 개화시기에 관여하는 것으로 보고된 많은 유전자들의 발현 조절을 통한 개화시기 조절 연구는 환경변화에 적응 가능한 배추의 형질을 개량하여 품질 및 생산성을 높이는데 중요하다고 할 수 있다.
개화는 식물이 영양생장에서 생식생장으로 전환되는 중요한 발달 단계로 주로 춘화처리 경로, 자발적 경로, 광주기 의존적 경로, 식물 호르몬인 지베렐린 연관 경로들이 밝혀졌다. 이들 중 봄에 꽃을 피우는 식물들은 가을에 개화가 억제되고 장기간의 저온기간인 겨울을 보내는 춘화처리가 개화를 유도 또는 촉진하기 위한 필수조건이다. 이러한 식물의 춘화처리에서 가장 중요한 역할을 하는 유전자는 개화 억제자로 알려진
FLC (
FLOWERING LOCUS C)이다.
FLC는 MADS-box transcription factor로 식물이 저온처리를 받기 전에 발현이 되어 개화를 유도하는 floral integrator 유전자인
SOC1(
SUPPRESSOR OF OVER EXPRESSION OF CONSTANS 1,
AGL20;
AGAMOUS-LIKE 20),
FT (
FLOWERING LOCUS T) 유전자들의 발현을 정교하게 억제하여 개화를 억제한다(
Michaels & Amasino 1999,
Sheldon et al. 1999, 2000,
He & Amasino 2005). 그 후 식물체가 장기간의 저온 처리를 받으면
FLC 발현이 억제되면서 개화 촉진 유전자들이 발현을 한다. 이러한
FLC 발현 억제는 저온 처리 이후에도 계속 유지가 되어 식물이 개화하는 것으로 알려져 있다. 장기간의 저온에 의하여 homeodomain finger 유전자인
VIN3(
VERNALIZATION INSENSITIVE 3)등의 발현이 유도되고 이로 인해 염색체 변형과 관련된 요인들이 작용하여 저온처리 후에도
FLC 유전자 발현 억제가 지속된다(
Sung & Amasino 2005,
Greb et al. 2007). 또 다른 MADS-box 유전자인
SVP (
SHORT VEGETATIVE PHASE)는
FLC와의 상호작용에 의하여 주요 개화 유전자
SOC1과
FT 유전자의 발현을 조절함으로서 개화 억제자로서의 역할을 수행 하는 것으로 나타났다(
Hartmann et al. 2000,
Michaels et al. 2003,
Lee et al. 2007a,
Li et al. 2008).
따라서 본 연구는 개화시기 경로에서 주요한 역할을 하는 배추 SVP유전자를 배추에 형질전환하여 개화시기를 분석하였으며, BrSVP 유전자가 배추의 개화시기를 조절하여 농업적 형질을 개선하기 위한 주요한 후보 유전자로 이용될 수 있다는 것을 제시하고자 하였다.
재료 및 방법
식물 형질전환 벡터 제작
배추 형질전환을 위해서
BrSVP cDNA를 제초제 Phosphinothricin (ppt) 분해 유전자 Phosphinothricin N-acetyltransferase (
bar-ppt resistance) 부위를 포함하는 pB2GW7 binary vector벡터의 CaMV 35S 프로모터와 35S 터미널(
35S-ter)사이에 융합하여 식물 형질전환용 벡터를 제작하였다(
Fig. 1A). 제작된 벡터를 freeze thaw 방법으로
Agrobacterium tumefaciens GV3101에 도입하였으며 유전자 도입이 확인된 콜로니를 배추 형질전환에 사용하였다.
배추 형질전환은 아그로박테리움을 이용한
Kim et al. (2007)의 방법과 유사하게 하였다. 배추는 만추대 특성을 가진 ‘inbred line DA001’ 품종을 본 실험에 사용하였다(
Lee et al. 2004). 표면 살균한 배추 종자를 MS 기본 배지에 파종하여 25ºC 배양실에서 6-7일 발아시킨 후 하배축을 0.5 cm 크기로 절단하여 전배양 배지(MS basal medium, 1 mg/L NAA, 3 mg/L BA, 2 mg/L AgNO
3, 3% sucrose, and 0.8% Phytagar)에서 2일 동안 배양시켰다. 전배양된 하배축 조직을 아그로박테리움과 15-20분간 접종시킨 후에 25ºC, 암 상태에서 공동배양 배지(MS basal medium, 1 mg/L NAA, 3 mg/L BA, 2 mg/L AgNO
3, 100 μM acetosyringone, 3% sucrose, and 0.8% Phytagar)에서 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양한 하배축을 100 mg/L carbenicillin, 250 mg/L cefotaxime이 첨가된 멸균수로 5-6번 세척하여 아그로박테리움을 제거한 후 선발 배지(MS basal medium, 1 mg/L NAA, 3 mg/L BA, 2 mg/L AgNO
3, 3% sucrose, 4 mg/L ppt, 100 mg/L carbenicillin, 250 mg/L cefotaxime, and 0.8% Phytagar)에 치상하였다. 신초가 형성될 때까지 새로운 선발배지에서 2-3주 간격으로 계대배양하였다. 재분화 되어 나온 신초를 식물 생장조절제가 포함되어 있지 않은 MS 배지로 옮겨 뿌리 형성을 유도하였다. 뿌리가 형성되어 생육이 왕성한 형질전환체를 순화시켜 춘화처리(4℃, 40일 처리) 후 온실에서 재배하여 뇌수분(bud pollination)으로 종자를 수확하여 세대를 진전시켰다. 형질전환체의 세대 진전을 위해 종자를 ppt 25 mg/L이 포함된 MS 기본 배지에 40개씩 파종하여 저항성을 나타내는 형질전환체만을 선발하여 온실로 옮겨 재배하였다.
Genomic DNA PCR과 RT-PCR을 통해
BrSVP 유전자 삽입 유무와 발현을 각각 확인하였다. 형질전환 배추 잎으로부터 genomic DNA를 분리하였다(DNeasy Plant Kit, Qiagen, Hilden, Germany). 분리된 genomic DNA 50 ng을 사용하여 형질전환 확인용 벡터 특이 프라이머 Gw-SF/Gw-SR를 이용한 PCR (95℃에서 3분, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초, 35 사이클, 72℃ 10분)로 식물체내 유전자 도입을 확인하였다(
Table 1).
도입된 유전자 발현을 확인하기 위하여 형질전환 식물체의 잎으로부터
Hong et al. (2013) 방법과 유사하게 total RNA를 분리한 후 역전사 효소(MMLV transcriptase RNase free, Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 total RNA 5 μg을 cDNA 라이브러리로 제작하고 1 μl를 PCR 증폭에 사용하였다(
Hong et al. 2017). 유전자 특이 프라이머를 이용하여 PCR (95℃에서 3분, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초, 25 사이클, 72℃ 10분 조건)로 유전자 발현을 확인하였고 염기서열 분석을 통해 도입된 유전자의 발현을 최종 확인하였다(
Table 1).
Bactin 유전자는 발현 수준을 확인 하기 위하여 정량적 대조군으로 사용되었으며 모든 실험은 3 반복으로 수행하였다(
Hong et al. 2010,
Yao et al. 2005).
형질전환체에서 개화 조절 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여
Kim et al. (2007)의 방법을 기본으로 하여 저온처리 (4℃)를 하지 않은 경우와 저온처리 20일, 40일, 저온처리 40일 후 상온에서 10일 생육 된 형질전환체의 잎으로부터 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 total RNA를 분리하였다. 개화 관련 유전자 특이 프라이머들을 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다(
Table 1). Semi-quantitative RT-PCR 결과로부터 Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA;
Liang et al. 2011)과 GelQuant.NET (
http://biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html)을 이용하여 상대적 발현 수준을 측정하였으며 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
형질전환체에서 개화 일수를 확인하기 위하여 Kim et al. (2007, 2011)이 기술한 방법으로 최종 선발된 계통의 배추 종자를 전라북도 전주시 국립농업과학원 농업생명자원부 GM온실에 2019년 1월 4일에 파종하여 본엽이 4-5장 되었을 때인 1월 16일에 선발 계통 별로 5개체씩 4℃에서 40일 동안 춘화처리 후 2월 25일에 GM온실로 옮겨 상온에서 재배 하였다 형질전환 배추의 추대시기는 꽃봉오리가 배추기부에서 육안으로 보이는 때까지 소요되는 일수로 조사 하였으며 대조군으로는 같은 시기에 파종하여 저온 처리한 비형질전환체 5개체가 사용되었다.
삽입유전자 염기서열분석(Flanking DNA sequencing)
형질전환체에서 도입 유전자를 포함하는 T-DNA의 genomic DNA내 삽입된 위치를 확인하기 위해 분리된 genomic DNA (100ng/µl) 20 µl를
HincII와
HaeIII 제한효소로 자르고 adaptor와 ligation 시켰다. T-DNA와 adaptor의 특정 프라이머 LB1/RB1 과 A1를 이용하여 1차 PCR을 수행하였다(
Table 1). 정확한 T-DNA 주변 염기서열을 분석하기 위하여 1차 PCR산물을 LB2/RB2와 A2 프라이머를 시용하여 2차 PCR을 수행하였다(
Table 1). 2차 PCR 산물의 염기서열을 확인 하였으며 Brassica database (
http://brassicadb.org/brad/)에서 T-DNA 삽입 인접 염기서열 부분을 확인하였다.
결과 및 고찰
BrSVP 유전자 배추 형질전환 및 개화시기 분석
저온에 감응하여 추대하는 특성을 가진 배추는 급작스런 온도 변화로 저온에 반응하여 조기 추대가 유도되면 배추의 상품성 저하를 가져오기 때문에 국내⋅외적으로 해결해야 될 중요한 문제로 제시되고 있다(
Kim et al. 2011). 이러한 현상을 해결하기 위해 작물에서 추대 및 개화시기에 관여하는 유전자들을 활용하여 환경변화에 적응 가능한 작물을 개발하는 연구가 진행 중이다.
SVP 유전자는 작물이 영양생장에서 생식생장으로 전환하는 단계에서 적절한 시기에 개화를 할 수 있도록 개화를 억제하는 기능으로 개화시기 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(
Gregis et al. 2009,
Liu et al. 2009). 배추로부터 분리한
SVP는 애기장대에서 과발현 되었을 때 개화가 지연 되는 것으로 나타났다(
Lee et al. 2007b). 따라서 본 연구에서는 애기장대에서 개화억제 기능이 확인된 배추
SVP를 배추에 도입하여 추대 시기가 지연된 형질전환체를 세대별로 선발하여 추대가 지연된 고정계통을 최종 육성하고자 하였다.
BrSVP 유전자와 제초제 성분인 Phosphinothricin (ppt) 분해 유전자(
Bar)를 포함한 식물 형질전환 벡터를 제작 후 아그로박테리움을 사용하여 배추에 형질전환 하였다. ppt에 저항성을 보이는 형질전환체를 선발한 후 뇌수분으로 종자를 수확하였다. 169 계통 T
0 종자를 ppt 25 mg/L에서 발아시켜 제초제 저항성과 감수성을 조사하여 비율이 3:1로 나타나는 35 계통을 선발하여 각 계통 당 5 개체를 온실에서 재배하여 종자를 확보하였다. 확보한 종자를 파종하여 전개된 T
2 식물체에서 제초제 저항성을 모두 나타내면서 개화시기가 지속적으로 지연된 독립된 T
2 세대 8계통을 최종 선발하였다. T
2 종자를 파종하여 T
3 세대 식물체에서 각 유전자의 특이 프라이머를 이용해 genomic DNA PCR로
BrSVP 유전자 도입을 확인하였다(
Fig. 1B). Semi-quantitative RT-PCR로 유전자 발현을 확인한 결과 비형질전환체에 비하여 형질전환체에서
BrSVP 유전자 발현이 월등히 높았다(
Fig. 1C). 이 결과 T
3 세대 식물체에서 모두 도입된 유전자가 안정적으로 삽입되어 유전되었다는 것을 알 수 있었다.
도입한
BrSVP가 형질전환 배추의 개화시기 조절에 미치는 영향을 분석하고자 본엽이 4-5장으로 생장된 T
3 형질전환 배추를 40일 동안 저온처리(춘화처리) 후 온실에서 재배한 날부터 꽃봉오리가 배추 기부에 육안으로 보일 때까지의 소요된 일수를 조사하였다.
Table 2는
BrSVP 유전자가 도입된 T
3세대에서 계통 별로 각 계통 내에 있는 개체들에서 개화시기에 소요되는 평균일수를 나타낸 것으로 선발된 계통 모두 대조구보다 개화시기가 늦었다. 비형질전환 배추는 16일째 모든 개체에서 꽃봉오리가 관찰되었으나 형질전환 배추는 평균 21-24일이 소요되었으며 모든 계통 들에서 개화시기가 지연된 것을 확인 하였다(
Table 2,
Fig. 2). 선발된 계통 내에서 가장 빠른 개체의 개화시기 소요일수는 19일이었으며 가장 늦은 개체의 개화시기 소요일수는 25일이었고 비형질전환체보다 3-9일 정도 개화시기가 지연되는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통하여 배추에서 분리된
SVP유전자는 기존에 보고된 애기장대에서뿐만 아니라 배추에 도입되었을 때도 안정적으로 발현하여 개화시기를 지연시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
개화시기를 조절하는 연구는 많은 작물에서 수행되었으며 배추속 작물 및 다양한 작물에 개화 촉진이나 억제 유전자를 활용하여 개화 시기를 조절하는 연구가 보고되었다(
Jung & Műller 2009). 배추 개화 억제 유전자
BrFLC1과
BrFLC3가 형질전환된 배추는 평균적으로 개화시기가 3-23일 지연되었다(
Kim et al. 2011). 개화 촉진 유전자
BrAGL20 유전자가 과발현된 유채는 저온처리가 없는 상태에서 비형질전환체 비하여 11-37일 정도 개화시기가 빨라진 현상을 나타내었다(
Hong et al. 2013). 겨자(
S. alba)의
FUL-like MADS-box 유전자
MADSB가 도입된 여름형 유채는 개화시기가 3-15일 빨라지고 종자 성숙이 촉진되었으며 겨울형 유채는 개화에 필요한 엄격한 춘화처리 조건이 일부 낮게 완화되었다(
Chandler et al. 2005). 또한 애기장대
AtFLC가 도입된 여름형 유채에서는 개화가 지연되었다(
Tadege et al. 2001). 최근에는 사과나무 등의 다년생 과수 작목에서 농업적 형질을 개선하기 위해
SVP유전자의 발현 조절을 통해 개화 시기 조절 및 목본식물의 줄기 생장 등을 조절하는 연구가 수행되었다(
Wu et al. 2017). 본 연구 결과에서도
BrSVP를 배추에서 과발현 시켰을 때 개화가 지연되는 특성을 나타냈으며 이러한 결과들은
BrSVP의 발현 조절을 통해 작물에서 개화시기 조절이 가능하여 작물의 생산성, 상품가치 등의 형질 특성을 향상시킬 수 있을 것이다.
배추는 춘화처리가 개화를 유도 또는 촉진하기 위한 필수조건이다.
SVP는 배추 춘화처리에서 가장 중요한 역할을 하는 유전자인
FLC와 상호작용에 의하여 개화 억제자로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있다(
Hartmann et al. 2000,
Lee et al. 2007a,
Li et al. 2008). 이들의 상호 조합은 개화를 유도하는 floral integrator 유전자인
AGL20, AGL24,
FT의 활성을 억제하여 개화를 억제한다고 보고 되었다(
Michaels & Amasino 1999,
Sheldon et al. 1999, 2000,
He & Amasino 2005). 따라서
BrSVP가 형질전환 배추에서 floral integrator 관련 유전자들의 발현 조절을 통해 개화 시기에 영향을 주었을 것으로 예상되어 이들 유전자들의 발현 양상을 조사하였다. 배추 유전체 정보로부터
AGL20, AGL24,
FT, FLC 유전자들의 특이 프라이머를 제작하여 형질전환체를 춘화처리 전, 춘화처리 20일과 40일, 춘화처리 후 10일째 잎에서 시료를 확보하여 RT-PCR을 수행하였다(
Table 1,
Fig. 3). 개화시기가 늦은 형질전환 배추에서
AGL20은 춘화처리 전과 춘화처리 20일까지 비형질전환체 보다 발현량이 감소하였다(
Fig. 3).
AGL24는 춘화처리 전과 춘화처리 20일, 40일까지 비형질전환체보다 발현량이 상당히 감소하였다. 개화경로에서 가장 중요한 역할을 하는 floral integrator인
FT은 춘화처리 전과 춘화처리 20일째까지 발현을 확인 할 수 없었으나 처리 40일째부터 발현을 확인할 수 있었으며 개화시기가 늦은 형질전환체에서
FT 발현량은 비형질전환체보다 현저히 감소한 것으로 나타났다. 춘화처리가 시작되면서 발현이 되지 않는 것으로 알려진
FLC1은 비형질전환체와 형질전환 배추에서 모두 춘화처리 이후 발현을 확인 할 수 없었다.
FLC1은
SVP 보다 상위 유전자로
SVP 과발현이
FLC1의 발현에 직접 영향을 주지 않았다. 따라서 형질전환 배추에서 도입된
BrSVP 유전자는
AGL20,
AGL24,
FT유전자들의 발현을 억제시킴으로써 개화시기 지연 효과를 나타냈다.
식물체에서 floral transition동안 개화시기 조절 유전자
FCL,
SVP,
AGL20(
SOC1),
AGL24,
FT 유전자들은 floral organ identity에 관여하는 다양한 유전자들과 상호작용에 의해 조절된다. 춘화처리 개화유도 경로에서
SVP는 저온에 노출되었을 때
AP1과 결합하여
AGL20의 활성을 억제하고 동시에
AGL24와 결합하여 적절할 개화시기까지 개화 조직의 발달을 억제 시키는 역할을 수행한다고 보고되었다(
Gregis et al. 2009,
Torti et al. 2012,
Yu et al. 2002). 또한 이 경로에서
SVP와
FLC의 결합은 주요 개화 유전자인
FT의 발현을 감소 시켜 개화를 억제한다(
Lee et al. 2007b,
Li et al. 2008,
Michaels et al. 2003).
Liu et al. (2008)은
SVP가
AGL24와
SOC1과 함께 결합하여 개화되는 적절한 시기까지 꽃 분열조직의 조기 분화를 억제하고 floral transition에서
SVP의 활성이 억제될 때
AGL24와
FT가
SOC1 (
AGL20)의 발현을 촉진시키는 것으로 보고 하였다.
Lee et al. (2007b)은 배추
SVP유전자를 형질전환 하여 개화가 지연된 애기장대에서 도입된 배추
SVP가 애기장대
FT와
SOC1 발현을 억제하는 것으로 보고 하였다. 따라서 형질전환 배추에 도입된
SVP 유전자는 기존 연구와 유사하게 춘화처리 동안 floral integrator 유전자들의 발현을 억제시키고 있으며 특히
AGL24와
FT의 발현을 더 강하게 억제함으로써 개화시기 지연을 유도하는 것으로 예상할 수 있다.
본 연구 결과 배추 SVP 유전자는 배추에서 춘화처리 동안 floral integrator 유전자들의 발현에 영향을 주어 개화시기를 조절 할 수 있는 유용 유전자로서의 기능을 할 수 있을 것이다.
삽입유전자 염기서열분석(Flanking DNA sequencing)
T-DNA을 이용한 형질전환은 외래 또는 변형된 유전자를 식물에 도입하여 식물 기능을 변경하거나 분자 육종을 목적으로 사용되는 주요 접근법이다. 그러나 T-DNA는 형질전환체의 게놈에 무작위로 삽입되어 여러 개의 유전자 좌에 삽입되거나 여러 개의 T-DNA가 삽입될 수 있고 특정 유전자에 삽입되어 고유한 특성이 변이된 돌연변이체를 생성하기도 한다(
De Buck et al. 2009,
Oltmanns et al. 2010). 형질전환 식물체에서 T-DNA 삽입을 통한 유전자들의 결실과 이로 인해 유도된 특성 변화를 확인하기 위해 게놈 DNA에서 T-DNA 삽입 인접 염기서열 분석이 필요하며 삽입 부위에 관한 정보는 형질전환 식물체의 안정성 평가를 위한 중요한 분자생물학적 정보를 제공한다(Spalinska et al. 2013). 따라서 개화시기가 지연된 형질전환 배추 3계통(#3, #6, #7)에서 도입된
BrSVP의 genomic DNA내 삽입된 위치를 확인하기 위해 T-DNA 삽입 인접 염기서열 분석을 하였다. 분석 결과 각각의 형질전환 배추에서 염색체 5번의 2567129bp-2567394bp사이, 염색체 9번의 14851639bp-114851368bp사이, 염색체 9번의 19565583bp-19565861bp사이에서 T-DNA삽입을 확인 하였으며 이들은 Bra004936, Bra017384, Bra027996 유전자 전사시작점의 상위 1.5kb, 2.6kb, 18kb 위치에 도입된 것으로 확인되었다(
Fig. 4). 이러한 결과는 T-DNA가 다른 유전자 전사영역에서 벗어나 삽입된 것을 알 수 있으며 직접적으로 유전자 결실이나 변이는 유도하지 않았다. 따라서 형질전환 배추에 삽입된 T-DNA는 각각의 유전자 좌에서 주위 유전자들의 변이 없이 도입된
BrSVP 유전자의 과발현을 통해 floral integrator 관련 유전자의 발현을 억제시킴으로써 개화시기를 지연시키는 것으로 나타났다.
적 요
SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)는 MADS-box를 갖고 있는 식물 전사조절인자로 FLC와 상호작용에 의하여 개화 억제자로서 역할을 하고 있다. 배추로부터 분리된 BrSVP 유전자를 35S 프로모터에 결합시켜 식물 형질전환 벡터를 제작한 후 아그로박테리움을 이용하여 배추에 형질전환하였다. 선발된 형질전환체의 특성을 분석한 결과 춘화처리 후에도 개화시기가 지연되는 것으로 나타났다. RT-PCR로 유전자 발현을 분석한 결과 BrSVP유전자는 floral integrators AGL20, AGL24, FT 유전자의 발현을 감소 시킴으로써 배추의 개화 및 추대시기를 지연시키는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구 결과로부터 BrSVP 유전자는 생명공학기술을 활용하여 개화시기를 조절할 수 있는 유용 유전자원으로 이용될 수 있을 것이다.
사 사
본 논문은 농촌진흥청 어젠다사업(과제번호:PJ014174)의 지원에 의해 이루어진 것이다. 또한 본 연구는 2020년도 농촌진흥청 국립농업과학원 전문연구원 과정 지원사업에 의해 이루어진 것이다.
Fig. 1The expression of BrSVP in transgenic B. rapa plants. (A) Structure of the 35S-Pro::BrSVP construct. The Bar gene under the control of the nopaline promoter (nos-pro) serves as a selectable marker for B. rapa transformants. BrSVP was regulated by 35S-Pro. LB and RB indicate left and right borders of T-DNA, respectively. (B) The confirmation of the presence of BrSVP and Bar transgenes using genomic PCR analysis. (C) Semi-quantitative RT-PCR for determination of BrSVP expression in transgenic plants (upper panel). The expression level of Bactin was used as a quantitative control. Relative expression level of BrSVP transgene (lower panel). Error bars represent the standard error (SE). Wt, untransformed wild-type plants; lanes #1-#8, selected transgenic lines, respectively.
Fig. 2Flowering-time phenotype of BrSVP overexpressing transgenic plants. 40dV23, 23 days at 25°C after a 40-day exposure to 4°C; 40dV28, 28 days at 25°C after a 40-day exposure to 4°C. Wt, untransformed wild-type plants; Transgenic lines, BrSVP overexpressing transgenic plants.
Fig. 3Expression patterns of floral regulator genes in B. rapa transgenic plants transformed with BrSVP. FLC, FLOWERING LOCUS C; AGL20 and AGL24, AGAMOUS-LIKE 20 and 24; FT, FLOWERING LOCUS T. 0d, 20 day-old plants before cold treatment (4°C); 20dV, 20-day exposure to 4°C; 40dV, 40-day exposure to 4°C; 40dV10, 10 days at 25°C after a 40-day exposure to 4°C. Wt, untransformed wild-type plants; lanes #1-#8, selected transgenic lines, respectively.
Fig. 4Structure and position of T-DNA insertion in BrSVP overexpressing transgenic plants. Black boxes indicate genes. Numbers indicate chromosome positions. LB and RB indicate left and right borders of T-DNA, respectively. #3, #6, and #7, selected transgenic plant lines.
Table 1Oligonucleotide primers used in RT-PCR
Table 1
|
Target |
Acc. No. |
Primer sequences |
Expected size (bp) |
|
BrAGL20
|
Bra000393 |
5'-ATGGTGAGGGGCAAAACTCAGATGAAG-3' |
642 |
|
5'-TCACTTTCTTGAAGAACAAGGTAACCC -3' |
|
BrAGL24
|
Bra019221 |
5'-ATGGCGAGAGAAGATAAGG -3' |
666 |
|
5'-TCATTCCCAAGATGGAAGCCC-3' |
|
BrFCL1
|
Bra028599 |
5'-ATGGGGAGGAAGAAACTTGAAATCAAG-3' |
621 |
|
5'-CTATAAAAATTCCACTCCCACTAACC-3' |
|
BrFT1
|
Bra022475 |
5'-ATGTCTTTAAGTAATAGAGATCCTC-3' |
528 |
|
5'-CTAACTTCTTCGTCCTCCGCAGCCAC-3' |
|
BrSVP
|
Bra038511 |
5'-ATGGCGAGAGAAAAGATTCAGATCAGG-3' |
726 |
|
5'-CTAACCACCATACGGTAAGCCGAGCC -3' |
|
Bactin
|
|
5'-TGGCATCACACTTTTCTACAA-3' |
516 |
|
5'-CAACGGAATCTCTCAGCTCC-3' |
|
Gw-S
|
|
5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' |
779 |
|
5'-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3' |
|
LB1
|
|
5'-TTCAAGCACGGGAACTGGCATGAC-3' |
|
|
LB2
|
|
5'-GTTTCTGGCAGCTGGACTTC-3' |
|
|
RB1
|
|
5'-AGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAG-3' |
|
|
RB2
|
|
5'-AAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGT-3' |
|
Table 2Phenotypes of flowering time in B. rapa transgenic plants after vernalization. Transgenic plants transformed with the BrSVP gene were exposed to low temperature (4℃) for 40 days.
Table 2
|
Genes |
Line |
Plant line |
Days to visible flower bud in plants |
|
No gene inserted |
Wt |
B. rapa ssp. pekinensis
|
16(16±0)z
|
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|
BrSVP genes
|
Line
|
Transgenic plant lines
|
Days to visible flower bud in transformants
|
|
|
#1 |
32(T0)-1(T1)-3(T2)-1~5(T3) |
19-22(21±1.4*) |
|
#2 |
33-2-5-1~5 |
22-25(24±1.6*) |
|
#3 |
58-1-1-1~5 |
19-22(21±1.6*) |
|
bar-35S::BrSVP |
#4 |
64-1-1-1~5 |
19-25(22±2.5*) |
|
#5 |
121-1-2-1~5 |
22(22±0) |
|
#6 |
135-1-3-1~5 |
19-22(21±1.6*) |
|
#7 |
138-1-3-1~5 |
22(22±0) |
|
#8 |
164-1-3-1~5 |
22-23(22±0.5*) |
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